Diese Arbeit wurde von FWO-Vlaanderen, der IOF Projekt IOF10 / StartT / 027 und der Universität Gent Sonderforschungsstipendium BOF12 / GOA / 014 unterstützt.

Hinweis: Die nach der Transfektion und Co-Immunopräzipitation Protokoll wird für einen 9 cm Petrischale Format etabliert. Andere Formate sind auch nach der Skalierung des Protokolls möglich. 1. Seeding die humane embryonale Nierenzellen (HEK) 293T-Zellen <ol><li> Samen der HEK293T Zellen einen Tag vor der Transfektion mit 1,2 x 10 6 Zellen pro 9 cm Petrischale in 12 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 0,4 mM Natriumpyruvat ergänzt, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin. </li><li> Wachsen die Zellen 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sichtprüfung der Morphologie und der Lebensfähigkeit der Zellen mit einem umgekehrten Lichtmikroskop vor der Transfektion. Die Zellen müssen subkonfluenten für optimale Transfektionseffizienz sein. </li></ol> 2. Calciumphosphat-Transfektion von HEK293T Zellen Notiz: Verwenden 0,5-1 ug pCAXL-NP oder leer pCAXL Plasmid in Kombination mit 1-3 ug pCAXL-Mx1 pro 9 cm Schale. Verwenden eine gleiche Menge an Gesamt Plasmid DNA in allen Proben; einstellen mit leeren Plasmid, wenn nötig. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Transfektion Puffer: <ol><li> Bereiten Tris-EDTA (TE) mit Konzentrationen von 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 und 0,1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Bereiten BS / HEPES mit Konzentrationen von 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 274 mM NaCl (16 g / L), 10 mM KCl (0,74 g / L), 1,5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / l) und 11,1 mM Dextrose (2 g / L). PH-Wert auf 7,05. </li><li> Bereiten CaCl 2 / HEPES mit Konzentrationen von 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / l) und 125 mM HEPES (29,79 g / l). PH-Wert auf 7,05 mit NaOH. </li></ol></li><li> Warm die Transfektion Puffer bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die Plasmid Proben hergestellt durch Verdünnen der Plasmid-DNA in 600 ul TE.Diese Mischungen sind in Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li><li> Fügen Sie 150 ul CaCl 2 / HEPES in einer tropfenweise Art und Weise an die Plasmid-Proben und mischen durch Pipettieren 3 mal nach oben und unten. </li><li> Bereiten Sie die Transfektionslösung von tropfenweiser Zugabe der Plasmid-Lösung (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES, 750 ul) zu 750 ul der BS / HEPES-Puffer in einer frischen Platte mit 6 Vertiefungen vorgesehen sind. Verteilen Sie die Plasmid-Lösung gleichmäßig über die gesamte Vertiefung, die BS / HEPES-Puffer. </li><li> Schüttle die Transfektionslösung auf einem Plattenschüttler für 90 sec bei 1.000 UpM. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie den Transfektionslösung (1,5 ml) tropfenweise zu den Zellen. Verwenden Sie einen P1000 Mikropipette, die Transfektionslösung auf die Zellen tropfen. Zerstreuen Sie die Mischung über den gesamten 9 cm Petrischale und schütteln Sie die Platte ganz sanft. </li><li> Die Zellen für 6 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Dann entfernen Sie das Medium durch Absaugen und wi sofort zu ersetzenth 12 ml frisch, vorgewärmte Medium. Die frisches Medium zu den Zellen hinzu sanft auf Zellablösung zu verhindern. Dazu halten Sie die Spitze der Pipette an der Seite des Brunnens und drücken Sie sie vorsichtig aus dem Medium. </li><li> Die Zellen für weitere 16 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Co-Immunpräzipitation Hinweis: Führen Sie die Co-Immunopräzipitation 24 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> Vorbereitung des geringen Salz Lysepuffer und hohen Salzwaschpuffer. <ol><li> Wird eine Stammlösung von 2 M N-Ethylmaleimid (NEM) durch Wiegen der Menge an NEM und in absolutem Ethanol gelöst wird. Bereiten Sie die NEM-Stammlösung frisch vor Gebrauch. ACHTUNG: NEM ist sehr giftig, vorzubereiten und diese Stammlösung in einem Abzug. </li><li> Bereiten niedrigen Salz Lysepuffer in einer Konzentration von 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% NP40 und eine Protease-Inhibitor-Cocktail (aufzulösen 1 Tabellet in 50 ml Lyse-Puffer). Hinzufügen NEM bis zu einer Endkonzentration von 25 mM (dh 1:80 verdünnt). Halten Sie auf dem Eis nach der Zugabe der Protease-Inhibitoren und NEM. Hinweis: Achten Sie stets darauf, die Protease-Inhibitoren und NEM vor Gebrauch frisch. </li><li> Vorbereiten einer Hochsalzwaschpuffer in Konzentrationen von 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA und 1% NP40. Beachten Sie, dass der hohe Salzwaschpuffer nicht NEM enthalten. </li></ol></li><li> Herstellung von Zelllysaten. <ol><li> Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 2 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sehr sanft fügen Sie den Waschpuffer, wie HEK293T-Zellen lösen leicht. </li><li> Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 600 ul eiskaltem salzarme Lysepuffer pro 9 cm Petrischale. </li><li> Die Inkubation erfolgt während 20 Minuten auf Eis. Stellen Sie sicher, daß die Platten horizontal gehalten, um eine vollständige Bedeckung der Plattenoberfläche mit Lysepuffer gewährleisten. Schütteln Sie die Platten alle 5 min. </li><li> Sammeln des Zelllysats in einem 1,5 ml MikrozentrifugenRohr und Zentrifuge für 3 Minuten bei 4 ° C und 16.000 × g, um die unlösliche Fraktion zu pelletieren. </li><li> Übertragen Sie die lösliche Fraktion, dh dem Zelllysat in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten. Unmittelbar mit dem Co-Immunpräzipitationsprotokoll fortzusetzen, um eine Dissoziation der interagierenden Proteine ​​zu verhindern. Führen alle folgenden Schritte so weit wie möglich auf Eis oder bei 4 ° C, um die proteolytische Aktivität in den Lysaten zu begrenzen. </li></ol></li><li> Erzeugung von Immunkomplexen. Anmerkung: In diesem Schritt wird das Protein von Interesse mit dem entsprechenden Antikörper gebunden ist. Um die NP-Mx1 Interaktion zu studieren, mit einem Maus-Anti-NP monoklonaler Antikörper. <ol><li> Für jede Probe mischen 135 ul Lysat mit 2 &amp; mgr; l Anti-NP-monoklonalen Antikörper und 113 ul niedrigen Salz Lysepuffer (Gesamtvolumen 250 ul). Den übrigen Lysat bei -20ºC für eine weitere Analyse, wie Western-Blotting, um die Expressionsniveaus des vermuteten intera dokumentierenRésol Partner in den transfizierten Zellen. Anmerkung: Alternativ, die Proteinkonzentration des Lysats (zB mit Bradford-Reagens) und mit einem Betrag von Gesamtprotein, beispielsweise 400 &amp; mgr; g für jeden Lysats. </li><li> Inkubieren des Antikörper-Lysat Mischung für 3 Stunden auf einem sich drehenden Rad bei 4 ° C. Dieser Schritt kann auf eine Inkubation über Nacht verlängert werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Protein G-Kügelchen. Anmerkung: Die Protein-G-Kügelchen werden versandt und in 20% Ethanol zur Konservierung gespeichert. Die Wulst-Slurry besteht normalerweise aus 50% Perlen und diese Perlen gewaschen werden müssen, bevor sie verwendet werden, um die Immunkomplexen immunpräzipitieren. <ol><li> Benutzen 50 ul Perlen, also 100 ul Kügelchen-Aufschlämmung, für jede Probe. Die Menge der Kügelchen für alle Proben in der Co-Immunpräzipitationstest in einem Rohr erforderlich waschen. Schneiden Sie die Spitze eines 1 ml Pipettenspitze zu Pipetten der Wulst-Slurry zu erleichtern. </li><li> Zentrifugieren Sie die Protein G Kügelchen-Aufschlämmung bei 8.000 xg und 4 ° C für 30 sec. Entfernen Sie die Ethanollösung und das gleiche Volumen des geringen Salz Lysepuffer. Zentrifugieren Sie die Protein G Kügelchen-Aufschlämmung bei 8.000 xg und 4 ° C für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal. Hinweis: Die salzarme Lysepuffer verwendet, um die Perlen zu waschen muss nicht Protease-Inhibitoren oder NEM enthalten. </li><li> Schätzen Sie das Volumen von Protein G-Kügelchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen geringer Salz Lysepuffer, eine neue 50% Perlen Schlamm in geringen Salz Lysepuffer zu machen. </li><li> Für jede Probe wurden dann 100 ul der Wulst-Slurry in einem frischen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Sei vorsichtig, um die Wulst-Aufschlämmung vor dem Teilen zu resuspendieren, da diese Perlen schneller sedimentieren am Boden des Rohrs. </li></ol></li><li> Immunpräzipitation der Immunkomplexen durch Protein G-Kügelchen und ihre Elution. <ol><li> Vor der Verwendung der Protein G-Kügelchen für die Immunpräzipitation, Zentrifugieren Sie alle Röhrchen 30 s bei 8.000 xg und 4 ° C undDurch visuelle Überprüfung, dass es eine gleiche Menge an Perlen in allen Proben vorhanden. Falls erforderlich die Menge an Perlen in einigen der Proben und Zentrifuge wieder. Die Überstände verwerfen. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören. </li><li> Kurz zentrifugieren Immunkomplexen (dh., Lysaten mit Antikörper, 250 ul) für 30 sec bei 8.000 x g und 4 ° C, um die gesamte Probe zu dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Übertragen Sie die Immunkomplexen auf die Protein G-Kügelchen (50 ul). </li><li> Inkubiere 60 min auf einem sich drehenden Rad bei 4 ° C. Inkubieren Sie nicht diese Immunkomplexe länger als 75 min mit den Perlen, um unspezifische Bindung von Proteinen an die Protein-G-Perlen zu verringern. </li><li> Zentrifugieren Protein G-Kügelchen (mit gebundenen Immunkomplexe) für 30 sec bei 8.000 x g und 4 ° C und Entfernen der Überstände. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören. Optional: Speichern dieses Überstände bei 4 ° C oder -20 ° C für eine spätere Analyse,beispielsweise um die Menge an ungebundenen Proteins abzuschätzen. </li><li> Für etwa 5 min mit 900 ul Hochsalz Lysepuffer waschen die Protein G-Kügelchen. Stellen Sie sicher, dass die Beads vollständig im Waschpuffer für optimale Wasch suspendiert. Zentrifugieren Sie die Protein G-Kügelchen für 30 Sekunden bei 8.000 xg und 4 ° C und entsorgen Sie die Überstände. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4 mal. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören, um den Verlust von immunpräzipitierten Material vermeiden. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer zu den Kügelchen und erhitzt die Suspension 10 min bei 95 ° C, um die (Co) immunpräzipitierten Proteine ​​zu eluieren. <ol><li> Herstellung von 10 ml 6x Laemmli-Puffer mit 1 g Natriumdodecylsulfat, 3,5 ml Glycerin, 3,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8 und 420 &amp; mgr; l β-Mercaptoethanol. Einzustellen, um ein Gesamtvolumen von 10 ml durch Zugabe von destilliertem Wasser. Verdünnen Sie 3-mal in destilliertem Wasser auf 2x Laemmli-Puffer zu erhalten. ACHTUNG: &amp;# 946; -Mercaptoethanol giftig ist, herzustellen und zu verwenden Laemmli-Puffer in einem Abzug. </li></ol></li><li> Nach dem Erhitzen Zentrifuge die Protein G-Kügelchen für 30 Sekunden bei 8.000 xg und die Proben bei 4 ° C (kurzfristig) oder -20 ° C (langfristig) zu speichern. </li></ol></li></ol> 4. Analysieren Sie den (Mit-) immunpräzipitierten Proteine <ol><li> Visualisierung der in dem Zelllysat und Eluat der Co-Immunopräzipitation von SDS-PAGE und Western-Blotting 20 21,22 vorhandenen Proteine. In der Regel laden Hälfte des Laemmli Eluat auf Gel. Achten Sie darauf, um die pelletierten Protein G-Kügelchen zu stören, wenn die Entnahme von Proben für die Gelbeladung. Mx1 und NP-Expression wurden mit einem anti-Mx1 und Anti-NP-Antikörper bzw. 14 offenbart. Die Banden wurden mit HRP-basierten Chemilumineszenz und einer Röntgenfilmentwickler detektiert. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen der antiviralen Proteine ​​und ihre virale Ziele ist sehr wichtig, um die Details des antiviralen Mechanismus dieser Proteine ​​zu verstehen. Dies kann neue Erkenntnisse darüber, wie Viren und ihren Wirten co-entwickelt geben und die Grundlage für die Entwicklung neuer antiviraler Strategien. Die hier beschriebene optimierte Coimmunpräzipitation Protokoll ermöglicht, die Interaktion zwischen der Maus Mx1-Protein und seine virales Ziel, das Influenza-NP-Protein zu unte...

Myxovirus Widerstand (Mx) Proteine ​​sind ein wichtiger Teil der angeborenen Immunabwehr gegen virale Pathogene. Diese Proteine ​​sind groß dynamin artigen GTPasen, die durch Typ I und Typ III Interferone induziert werden. Die entsprechenden Mx Gene in fast allen Wirbeltieren vorhanden sind in einer oder mehreren Kopien und deren Genprodukte hemmen ein breites Spektrum von Viren, einschließlich Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Virus), Rhabdoviridae (z. B. vesikuläres Stomatitis-Virus), Bunyaviridae (z. , La Crosse Virus) und Retroviridae (zB Human Immunodeficiency Virus-1) 1-4. Es ist unklar, wie diese Proteine ​​erkennen, wie ein breites Spektrum von Viren, ohne ersichtlichen gemeinsamen primären Sequenzmotive in dieser Viren. Analyse der Interaktion von Mx-Proteine ​​mit den viralen Ziele, die möglicherweise mit höherer Ordnung Komplexe mit anderen Wirtszellfaktoren, wird dazu beitragen, die molekularen Mechanismen zu verstehen that in der Rüstungswettlauf zwischen Viren und ihren Wirten entwickelt. Das Zusammenspiel von Säugetier Mx Proteine ​​und virale Ziele wurde sehr ausgiebig für den menschlichen M · A untersucht. Menschliche MxA können die Replikation vieler Viren, einschließlich der Orthomyxoviren Influenza A und Thogoto Virus zu hemmen. M · A bindet die Thogoto Virus Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs) und damit ihre Kern Eintrag, der in Block 5 der Infektion führt zu verhindern. Diese Wechselwirkung zwischen MxA und Thogoto Virus vRNPs wurde mit Co-Sedimentation und Co-Immunopräzipitation 6-9 gezeigt. Wie Mx-Proteine ​​hemmen Influenza-A-Viren ist weniger klar. Ein Hauptproblem ist, dass es nicht einfach ist, eine Wechselwirkung zwischen einem Mx-Protein und einem Influenza-Genprodukt zu demonstrieren. Ein Bericht zeigte eine Interaktion zwischen Mensch M · A und der NP-Protein in Influenza A-Virus infizierten Zellen 10. Diese Wechselwirkung kann nur durch Zusammen immunopr gezeigtecipitation wenn die Zellen mit dem Vernetzungsmittel Dithiobis (succinimidylpropionat) vor der Lyse behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung transiente und / oder schwach. Neuere Studien haben gezeigt, daß der Differenz Mx Empfindlichkeit verschiedener Influenza-A-Stämme wird durch die Entstehung des NP-Proteins 11,12 bestimmt. Im Einklang mit dieser, können Influenza-A-Viren zum Teil aus Mx Kontrolle entziehen durch Mutation spezifische Reste in der NP-Protein 13. Dies deutet darauf hin, dass das Hauptziel des Influenza-A-Viren, die für Wirts Mx das NP-Protein, in vRNP Komplexe wahrscheinlich NP montiert. Jedoch keines dieser neuere Studien zeigten eine Interaktion zwischen Influenza NP oder vRNPs und entweder menschlichen oder Maus MxA Mx1. Kürzlich haben wir gezeigt, zum ersten Mal, eine Wechselwirkung zwischen dem Influenza NP und der Maus Mx1-Protein mit einer optimierten Zusammen Immunpräzipitationsprotokoll 14, die hier im Detail beschrieben wird. Im allgemeinen co-immunoprecipitation ist einer der am häufigsten verwendeten biochemischen Ansätzen zur Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese Technik wird oft als Alternative Techniken, beispielsweise Hefe-Zwei-Hybrid bevorzugt, da sie es ermöglicht, Protein-Protein-Wechselwirkungen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Co-Immunfällung kann endogen exprimierten Proteine ​​durchgeführt werden, wenn Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse zur Verfügung. Alternativ können die Proteine ​​von Interesse in die Zelle durch Transfektion oder Infektion exprimiert werden, und ein Affinitäts-Tag verwendet werden. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen hat die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll ermöglicht die Detektion von schwachen und / oder transienten Protein-Interaktionen. Der Hauptbestandteil in dieser optimierten Protokolls ist die Zugabe von N-Ethylmaleimid (NEM) in der Zell-Lyse-Puffer. NEM ist ein Alkylierungsmittel, das mit freien Thiolgruppen wie gegenwärtig Cysteine ​​reagiert, bei einem pH von 6,5-7,5, um eine stabile Thio-Ester zu bilden(Abbildung 1). Bei höheren pH kann NEM auch mit Aminogruppen reagieren oder Hydrolyse 15 zu unterziehen. NEM wird typischerweise verwendet, um freie Thiolgruppen zu blockieren, um die Bildung einer Disulfidbindung zu verhindern oder zu hemmen, die enzymatische Aktivität. Zum Beispiel wird häufig verwendet, um NEM desumoylating Enzyme, die Cystein-Proteasen sind blockieren. In der beschriebenen Co-Immunpräzipitationsprotokoll wurde NEM anfänglich in dem Lysepuffer enthalten, da es war berichtet worden, dass die Sumoylierung von Influenzaproteine ​​können die Wechselwirkungen zwischen viralen Proteinen 16 beeinflussen. Unerwarteterweise ist der Zusatz von NEM erwiesen Taste, um die Wechselwirkung zwischen Influenza NP und Maus Mx1 durch Co-Immunpräzipitation dokumentiert sein. Es ist unklar, warum die Zugabe von NEM ist von entscheidender Bedeutung, um die NP-Mx1 Interaktion zu erkennen. Möglicherweise ist die Interaktion zu vorübergehenden und / oder schwach. NEM könnte die Interaktion, beispielsweise zu stabilisieren, unter Wahrung einer bestimmten Konformation Mx1, ein virales Protein oder sogar eine unbekannte dritte Komponente. Eine derartige stabilisierende Wirkung von NEM ist zuvor beobachtet worden, beispielsweise für das Zusammenwirken zwischen der Ribonukleotidreduktase M1 und sein Inhibitor Gemcitabin (F2dC) 17. Mx1 und NP beide enthalten mehrere Cystein-Reste, die durch NEM modifiziert werden könnte. Zum Beispiel wird eine aktuelle Studie von Rennie et al., Dass ein stielfrei M · A-Variante enthält drei Lösungsmittel ausgesetzt Cysteinreste, die von Iodacetamid geändert werden können. Mutagenierten Reste Serine beeinflusste nicht die enzymatische Aktivität des MxA, aber verhindert disulfidvermittelte Aggregation 18. Da diese Cysteine ​​in Mx1 erhalten, bedeutet dies, dass die analogen Cysteine ​​in Mx1 durch NEM und als solche beeinflussen dessen Konformation oder Löslichkeit modifiziert werden. Außerdem könnte NEM beeinflussen auch die GTPase-Aktivität von Mx1, die für die Anti-Influenza-Aktivität Mx1 ist, und dadurch die Wechselwirkung zwischen Mx1 und NP stabilisieren. Allerdings ist eine direkte Wirkung von NEM auf der GTPase activität der Mx1 ist unwahrscheinlich, da NEM ist auch erforderlich, um die Interaktion zwischen Influenza NP und GTPase inaktive Mutanten des Mx1 Protein 14 zu erkennen. Es ist klar, ist mehr Forschung notwendig, um die Wirkung von NEM auf der NP-Mx1 Interaktion zu entwirren. Zusammenfassend ermöglicht die beschriebene Coimmunpräzipitation Protokoll, um die Wechselwirkung zwischen der antiviralen Mx1-Protein und seine virales Ziel, das Influenza-NP-Protein zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um andere schwache bzw. transiente Interaktionen, die auf die Stabilisierung der spezifischen Proteinzustände hängen untersuchen. Protein-Protein-Wechselwirkung, die auf spezifische Konformationen abhängig sind zuvor beschrieben worden, beispielsweise Calcium-bindende Proteine ​​wie Calmodulin 19. Schließlich könnte die vorteilhafte Rolle der NEM auch andere Methoden, die Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Ko-Sedimentation Assays verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-Ethylmaleimid ist eine organische Verbindung, die verwendet werden können, um irreversibel ändern freien Thiolgruppen, beispielsweise zur Cysteinproteasen (Figur 1) zu hemmen. Die antivirale Mx1-Protein hemmt die Influenza-A-Virus-Replikation durch die Interaktion mit dem viralen Nukleoprotein. Die hier beschriebene optimierte Co-Immunopräzipitation-Protokoll ermöglicht, diese NP-Mx1 Interaktion zu studieren. HEK293T-Zellen wurden mit Expressionsvektoren für ...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Aufrufe.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.