Unterstützung wurde von Becton Dickinson Technologies zur Verfügung gestellt. Ansichten in dieser Vorlage geäusserten Meinungen sind diejenigen der Autoren und erheben keinen Anspruch auf die offizielle Politik der US-Regierung widerspiegeln. Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und anderen Bundesgesetzen und Verordnungen in Bezug auf Tiere und Experimente mit Tieren und hält sich an Prinzipien in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research Council, 1996, durchgeführt. Die Einrichtung, wo diese Forschung durchgeführt wurde vollständig von der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care International akkreditiert.

1. NALT Sammlung und Anzucht <ol><li> Einschläfern Mäusen unter Verwendung genehmigt IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Übertragen Mäusen zu einer aseptischen Arbeitsbereich oder Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie den Unterkiefer des Maus und reinigen Sie den oberen Gaumen mit Alkohol und Jod Tücher. </li><li> Verwenden Sie eine chirurgische Klinge Nr. 11 in der chirurgischen Messergriff zu sorgfältig geschnitten und Verbrauchssteuern den oberen Gaumen, indem Sie die Innenkontur der Maus Schneidezähne und Backenzähne. </li><li> Vorsichtig abziehen der Gaumen mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne zu reißen, um den Gaumen. </li><li> Dieser Schritt ist notwendig, um eine Kontamination der Kulturen zu reduzieren und zum Verarbeiten mehrerer Gaumen gestalten. Platz Gaumen in einzelne Wells in der ersten Spalte einer sterilen 48-Well-Platte mit 250 ul vollständige Kulturmedium vorgefüllt (37 ° C), bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 100 ug / ml Streptomycin, 100 UI / ml Penicillin, 50 ug / ml Gentamicinund 1 pg / ml Fungizon / Amphotericin. Die Medien sollten basisch gepuffert, wenn Gaumen in einem 5% CO 2/95% feuchter Luft Inkubator (37 ° C), oder nutzen Sie alternativ 10 mM HEPES pH 7,4, für Nicht-CO 2-Kultur gezüchtet werden. </li><li> Um den Gaumen zu waschen, verwenden Pinzette Gaumen in jedem aufeinanderfolgenden gut in einer Reihe zu bewegen, vorsichtig Ausklopfen zwischen Wäschen, bis der Gaumen mit insgesamt acht Wäschen unterzogen wurde. </li><li> Übertragen Sie die Gaumen in eine neue sterile 48-Well-Platte mit 250 ml frisches, komplettem Kulturmedium (37 ° C) in Brunnen. </li><li> Legen Sie die Platten mit den Gaumen in ein 37 ° C Inkubator zur Kultivierung für die Dauer der Studie. </li><li> Entnehmen Sie die Proben für die Analyse durch die Übertragung aseptisch 100 ul Medium aus Kultur-Wells in Eppendorf-Röhrchen alle 24 Stunden, ersetzen mit 100 ul frischen 37 ° C Kulturmedium. </li><li> Zentrifugation der Kulturmedien Proben bei 380 × g für 10 Minuten, 4 ° C, um Zelltrümmer zu pelletieren. </li><li> Den Überstand aus dem zentrifugierten Probe an die frische Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C bis zum Gebrauch zu analysieren. </li><li> Antigen-spezifische IgG, IgM und IgA oder sezerniert Zytokine werden in Gewebekultur-Überständen durch Standard-Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) gemessen. </li></ol> 2. Chirurgische Ablation von NALT <ol><li> Weibliche BALB / c Mäuse, 7-9 Wochen alt sind, eignen sich Themen, aber auch andere Stämme sind ebenfalls akzeptabel. Geben gelartige Nassfutter 3 Tage vor der Operation, um Maus, um Nahrung und Wasser ersetzen, die nach der Operation verabreicht wird, akklimatisieren. </li><li> Verwalten Sie einen Tropfen Metacam Schmerzmittel (1,5 mg / ml oder 0,05 mg / Drop) in die Mundhöhle vor der Operation. </li><li> Anesthetize Mäusen unter Verwendung genehmigt IACUC Führung, zum Beispiel mit einer Ketamin, Acepromazin, und Xylazin Gemisch (KAX) und gelten Puralube Vet-Salbe auf die Augen ein Austrocknen zu verhindern. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. Einnesthesia kann durch das Fehlen von Reflex auf einem sanften Einklemmen der Zehen bestätigt werden. </li><li> Administrieren 1 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid-Injektion USP) subkutan zwischen die Schulterblätter mit einer 22-28 Gauge-Nadel und Spritze, um mögliche Austrocknung der Maus nach der Operation zu verhindern. Auch verabreichen 0,1 mL Respiram subkutan zwischen die Schulterblätter mit einer 22-28 Gauge-Nadel und Spritze an gesunde Atmung während und nach der Operation zu fördern. </li><li> Stellen eine thermische Unterstützung für die Maus bei allen nachfolgenden Manipulationen. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage, und verwenden Sie zwei getrennte Schleifen von chirurgischen Naht um den oberen und unteren Schneidezähne zu hebeln den Mund öffnen, Freilegung der oberen Gaumen. </li><li> Verwenden Sie einen Nr. 11 Skalpell, um einen Einschnitt von etwa 3 mm in der Länge entlang der Mittellinie des oberen Gaumen in der Stelle des NALT machen. </li><li> Legen Sie eine 0,5 mm microcurette in den Einschnitt und vorsichtig unter die Kanten zu kratzenstören den NALT. </li><li> Cauterize den Einschnitt, um eine Blutung mit einem geraden feinen Schleife auf einem Thermokauter Gerät zu stoppen. </li><li> Weiter thermische Unterstützung während Maus wieder zu vollem Bewusstsein und Aktivität. </li><li> Geben Maus mit Kochsalzlösung subkutan bis zu dreimal am Tag, 1 ml pro Injektion zwischen den Schulterblättern, zu Austrocknung und bei Bedarf orale Schmerzmittel verhindern einmal täglich für 3 Tage nach der Operation. Bestimmen Sie Austrocknung der Haut durch Ausführen eines Zelt-Test für Hautturgor überprüfen. Fassen Sie die Haut und das Fell zwischen den Schulterblättern Schaufeln, so dass diese Tented auf. Wenn die Haut schnell wieder in den normalen, vorherigen Position, ist die Maus nicht dehydriert. Wenn die Haut bleibt erhöht und bewegt sich langsam, ist die Maus in einem Zustand der Dehydrierung und erfordert Kochsalzlösung. Geben Sie Nassfutter für mindestens drei Tage nach der Operation, um genügend Zeit zur Erholung zu gestatten. </li><li> Vor der Durchführung der experimentellen Verfahren, beobachten Mäuse für 8-10 Tage durch das Verfolgen Gewichtszunahme. Schlechte Gewicht Erholungnormalerweise darauf hin, unvollständige Gaumen Heilung, und diese Mäuse sollten von weiteren Studien zurückgezogen werden. </li></ol> 3. Vorbereiten NALT für Histologie und die Beurteilung des Erfolges NALT Chirurgie <ol><li> Der Erfolg der Operation NALT muss durch Histologie festgestellt, wie unten beschrieben. Nach Abschluss aller experimentellen Studien, bereiten Mäuse für die Schädel-Sammlung von euthanizing Verwendung genehmigt IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. </li><li> Fassen Sie den Nacken der Maus eingeschläfert. Entfernen Sie den Unterkiefer aus dem Rest des Schädels durch Schnippeln durch die Gelenkfortsätze mit einer Schere auf beiden Seiten. </li><li> Beginnend am Nacken, entfernen Sie die Haut und das Fell aus dem Schädel durch langsames Schälen und Schneiden in Richtung der ventralen Seite des Schädels. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Haut um den Nasenbereich und schnippeln die Haut von der Spitze der Schnauze vollständig zu entfernen. </li><li> Nehmen Sie den Schädel aus den Wirbeln Witzha snip der Schere. </li><li> Legen Schere in das Foramen magnum und schneiden auf halber Höhe des Schädels entlang der Mittellinie gegen die Permeation von Formalin in die Weichteile während der Fixierung ermöglichen. </li><li> Fix Schädels in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für 24 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Um entkalken, legen Sie die Probe und separaten Kassette, eingehüllt in Gaze zu Rexyn vom Berühren des Knochens, in der Flasche mit der Ameisensäure Mischung zu verhindern. Inkubieren Sie für 12 Stunden bei Raumtemperatur, dann kontinuierlich unter fließendem Wasser spülen für ca. 20 Minuten. </li><li> Schneiden Sie die Probe auf die Vergangenheit Septum und das Auge Umlaufbahnen mit einer Rasierklinge. </li><li> Sample und Kassette kann für kurzfristige in 10% NBF gespeichert werden. </li><li> Platzieren Sie Probe auf eine Gewebe-Prozessor für die Verarbeitung über Nacht. Dies geschieht, um Wasser aus der Probe zu entfernen, in Vorbereitung auf Paraffineinbettung. </li><li> Entfernen Sie verarbeiteten Gewebe, in einem Paraffin-Block mit der Schnauze nach unten einbetten, und lassen Sie es abkühlen. </li><li> Trim rough 15 um Querschnitte des Blocks mit einem automatisierten Mikrotoms, nähert sich die ungefähre Lage des NALT, dann weiter Schneiden in 5 um Abschnitte zur Montage auf Glas-Objektträger in einer 44,3 ° C warmes Wasserbad. </li><li> Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung Histologie sollte verwendet werden, um NALT Ablation zu beurteilen. </li></ol> 4. Sammlung von biologischen Proben von Mäusen 4,1 Serum <ol><li> Vorsichtig heben die Körpertemperatur mit einer Wärmelampe erhöht den Blutfluss. Blutentnahme durch Nicking die laterale Schwanzvene mit einer chirurgischen Klinge. Lassen Sie das Blut frei tropfen in eine Microtainer Serumtrennröhrchen. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf Nick mit einem saugfähigen Material, wie zB Gaze oder ein Handtuch, um den Blutfluss zu stoppen. </li><li> Lassen Sie die Blutgerinnung in den Microtainer für 30 Minuten, dann zwischen 6-15 x 1.000 g zentrifugieren für mindestens 90 Sekunden. </li><li> Getrennt Serum Transfer vom Microtainer in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen fürLagerung bei -80 ° C. </li></ol> 4,2 Saliva <ol><li> Halten Sie den narkotisierten Maus vertikal beim Pipettieren 20-30 ul sterilem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zwischen Wange und Zahnfleisch. Sammeln Sie die verdünnte Speichel durch Leiten Pipettenspitze zwischen Wange und Zahnfleisch. </li><li> Übertragen Sie die verdünnte Speichel in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. </li></ol> 4,3 Nasensekret <ol><li> Einschläfern Maus vor dem Sammeln Nasensekret, mit zugelassenen IACUC Führung. Vermeiden Sie die Verwendung von Inhalations-Anästhetika, die NALT beeinflussen können. </li><li> Halten Sie die Maus vertikal, sorgfältig pipettieren 30 ul sterilem PBS in ein Nasenloch und sammeln spülen aus anderen Nasenloch. </li><li> Übertragen Sie spülen in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. </li></ol> 4,4 Vaginalsekret <ol><li> Legen Sie die Spitze einer Mikropipette in die Öffnung des the Vulva einer Maus eingeschläfert werden, spülen Sie die Vagina mit 50 ul sterilem PBS und sammeln Sie alle Flüssigkeit durch Mikropipette. </li><li> Übertragen Sie spülen in ein frisches Röhrchen mit 10 l 2x Protease-Inhibitor und bei -20 ° C. </li></ol> 5. Antigen-spezifische Antikörper oder Cytokine in den gesammelten Proben können mittels ELISA oder einem anderen quantitativen Verfahren gemessen werden. 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 enthält eine allgemeine Schema der Schritte mit der Verarbeitung des NALT-haltige Gewebe für Ex-vivo-Analyse beteiligt. In 2 (A, B), wird die Größe des Gaumens dargestellt, sowie die Lage des den Schnitt während Ablationschirurgie (A), wie durch die gestrichelte Linie angedeutet. Die Lage des NALT sind durch Pfeile in der Prämolaren-Bereich auf einem ausgeschnittenen Hämatoxylin-gefärbten Gaumen in Abbildung 2 (C) und zeigt die parallel Gewebe angegeben. Abbildung 3werden die erforderlichen Schritte des NALT Störungen Operation zeigt Exposition der oberen Gaumen für den Zugang zu NALT (A, B), Ablation (C) und ein abschließendes Ätzung der Einschnitt (D). Eine typische H &amp; E Querschnitt der Nasenhöhle Umgebung des NALT vor der Operation wird in 3E gezeigt, während ein Bild der NALT Störung durch die microcurette direkt nach der Operation wird in 3F. Ausreichend Zeit zur Erholung von der Operation, sollten die Einschnitte geschlossen werden und der Nasenhöhle frei von NALT (3G). Typische experimentellen Ergebnisse unter Verwendung dieser Techniken erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt ist, verglichen Gewebekultur-Überständen und biologische Proben aus einer Studie eines Staphylokokken-Impfstoff (STEBVax). Die Mäuse wurden STEBVax durch intranasale (IN) oder intraperitoneale (IP) verabreicht werden. Der Impfstoff wurde mit einem Adjuvans, das die Toll-like Rezeptor 4-Weg 3,1 aktiviert formuliert<html> 4, und Kontrollen wurden nur Kochsalzlösung oder Impfstoff ohne Adjuvans gegeben. Cultured NALT aus experimentellen Gruppen erhalten sezernierte Antigen-spezifische Immunglobuline in Medium, das mittels ELISA messbar war. In diesem Beispiel (Abbildung 4A), zeigen die Ergebnisse, dass die größten Mengen an IgA durch NALT von Mäusen, geimpft, mit einer Subunit-Impfstoff mit Adjuvans erhalten wurden, wurden freigelassen. Biologische Proben (z. B. Serum, Speichel, Nasensekret, Vaginalsekret) von der Steuerung oder NALT-freien Mäuse erworben werden verwendet, um die in vivo Immunantwort auf Antigene nasal zum Vergleich mit den Gewebekulturen Ergebnisse Profils sein. In 4B Antworten IgA und IgG, um bei der Impfung waren signifikant ohne funktionelle NALT gesunken. Mengen an Antigen-spezifischen IgA waren im Allgemeinen größer als IgG in Schleimhautsekreten (Speichel, Nasenspülungen) der geimpften Mäuse. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der NALT Sammlung und ex vivo kultiviert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> 2. Visualisierung der Maus Gaumen, die die Position NALT und Chirurgie Schnitt. Größe und Lage der oberen Gaumen mit einer Operation Schnitt durch die gestrichelte Linie (A) bezeichnet; oberen Gaumen herausgeschnitten (B) oder gefärbt in Hämatoxylin (C), die parallel NALT im Bereich der Prämolaren Gaumen (dunkel gebeizt violett auf vorderen Seite des Gaumens sehen ). NALT durch Pfeile angedeutet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Abbildung 3. Chirurgische NALT Störung. Wichtigsten Phasen der Unterbrechung NALT Chirurgie: Rückenlage Blick Maus oberen Gaumen vor der Operation (A); Medianschnitt am oberen Gaumen gemacht, um die NALT (B) zuzugreifen; microcurette Sonde durch Medianschnitt eingefügt, um Struktur in NALT störenIntegrität (C); Kauterisation der Schnitt am Schluss der Operation (D). Mikroskopische Aufnahmen von Nasenhöhlen, H &amp; E gefärbten, vor der Operation (E); unmittelbar nach der Operation (F) und ein erfolgreich geheilt, NALT-freie Maus (G). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Abbildung 4. Impfstoff-spezifischen Antikörpern aus kultivierten NALT, Speichel, Nasensekret und von geimpften Mäusen gesammelt. NALT-freien oder normalen Mäusen der Kontrollgruppe wurden in IP oder mit STEBVax geimpft und biologischen Proben wurden gesammelt. Antikörper-Konzentrationen der Proben in dreifacher Ausfertigung wurden mittels ELISA gemessen. (A) NALT wurden aus Mäusen der Kontrollgruppe (nicht chirurgisch manipuliert) entnommen und kultiviert, um die Antikörper-Reaktionen zu untersuchen. Der Impfstoff-spezifischen IgA-Antwort in Kultur in geimpften Mäusen war statistisch signifikant von den Kontrollen (Student-t-Test, p ≤ 0,01 im Vergleich zu ohne Adjuvans oder keinen Impfstoff). (B) NALT Störungen wesentlich reduziert spezifischen Antikörper-Antwortenum bei der Impfung. Es zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den spezifischen Antikörper-Spiegel von NALT-und NALT +-Gruppen (keine Operation oder Steuerung Chirurgie) für alle Vergleiche außer Speichel IgG Ergebnisse (Student t-Test, p ≤ 0,05).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben gemeinsame Verfahren zur Entwicklung eines Tiermodells dargestellt, Erhalten biologischer Proben und Assays zur Untersuchung NALT-assoziierten Immunantwort 1-4. Es gibt weitere Faktoren, die während der Durchführung dieser Verfahren zu prüfen. Standard-sterile Techniken für Chirurgie und Gewebekultur sollten befolgt werden. Eine Kombination aus antibakterielle und antimykotische Mittel bei der Isolierung und Kultur, sowie das Beibehalten der sterilisierten Instrumente, Arbeitsbereich, desinfiziert und Gaumen verwendet werden um das Risiko der Kontamination. Speichel, Nasen-Wäschen und ähnliche Schleimhautsekret Proben sollten für mögliche Kontamination mit Blut untersucht werden, wie Serum-Antikörper in der Regel in höheren Konzentrationen gefunden werden. Ferner sollte Schleimhautsekreten nur geringfügig zur Analyse verdünnt werden, da niedrigere Konzentrationen von Antikörpern, die in diesen Proben im Vergleich zu Serum. Mäuse müssen warm gehalten werden direkt nach der Operation vor,entlüften Potenzial Anästhesie-induzierten Hypothermie. Alternate Ruhestätte Mäuse auf ihren Seiten während der postoperativen Erholung zu minimieren, unregelmäßige Atmung. Das chirurgische Verfahren ist effizienter mit drei Individuen, die zusammenarbeiten, um diese Aufgaben zu erledigen: eine Durchführung der Operation, ein, um das Halten der Mund offen zu unterstützen, und ein bis postoperative Betreuung bieten als die Mäuse von der Narkose erholen. Es ist notwendig, H &amp; E Färbung von kranialen Querschnitte am Ende aller experimentellen Verfahren oder Studien, um den Erfolg der Operation für jede Maus benutzen zu überprüfen. Mögliche Chirurgie Ergebnisse sind: vollständige und bilateralen NALT Ablation, Ablation unvollständige oder NALT intakt. Da nicht alle Operationen werden im vollständigen Verlust der NALT, Tiere mit Rest-oder intakt NALT führen können als interne Kontrollen eingesetzt werden. Ein weiteres mögliches Ergebnis ist, dass der Gaumen vollständig zu heilen ausfällt, lassen Sie eine Öffnung Anschluss der Nasenschleimhaut und der Mundhöhle. UnvollständigHeilung der Gaumen wird in geringen Gewichts und Gedeihstörungen führen, und diese Personen müssen aus entfernt werden. Untersuchen Impfstoff Reaktionen zunächst mit dem Maus-Modell wird dazu dienen, eine Rolle für NALT in der beabsichtigten Studienergebnis (Antikörper-Reaktion, Überleben, etc.) zu etablieren. Chirurgischen Entfernung der NALT erleichtert die Bestimmung der nasalen Beiträge zur lokalen und systemischen Immunität. Die chirurgische hier beschriebene Ansatz ist die direkteste Methode zur Gewinnung eines Maus-Modell ohne NALT. Wählen Knock-out Mausmodellen haben mangels NALT berichtet worden, aber diese Tiere sind auch in Zytokine oder Chemokine wesentlich für die Entwicklung von anderen sekundären lymphatischen Gewebe mangelhaft und bergen mögliche weitere Mängel 12,13. Ferner wurden die hier beschriebenen Verfahren für die Prüfung mehrerer Aspekte der Immunreaktion mit Ursprung in die Nasenwege entwickelt. Unsere experimentellen Ergebnisse beruhen auf Untersuchungen unter Verwendung des gesamten oberen palat BasisE aus der Maus für die Gewebekultur, obwohl es möglich ist, dass die Abschnitte verwendet werden können. Schließlich ist das gezüchtete NALT Modell brauchbar für die Durchführung von Experimenten vollständig in Gewebekultur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Edelstahl Steril chirurgische Messer, Nr. 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Messergriff, Nr. 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48-Well-Zellkulturplatten </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum, hitzeinaktiviertem </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Endkonzentration: 10 Vol.% in Kulturmedien </td></tr><tr><td> Streptomycinsulfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Endkonzentration: 100 ug / ml </td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Endkonzentration: 100 IE / ml </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ml </td><td> Endkonzentration: 50 pg / ml </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Endkonzentration: 1 pg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Endkonzentration: 10 mM </td></tr><tr><td> Eppendorf Reaktionsgefäße </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-Gel-Kirschgeschmack Maus Nassfutter </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-TRAY </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Ein Tropfen von 1,5 mg / ml Suspension zum </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Abschließende CoNC: 6,06 mg / mL </td></tr><tr><td> Acepromazin </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Endkonzentration: 0,061 mg / mL </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Endkonzentration: 0,667 mg / mL </td></tr><tr><td> Puralube Vet-Salbe </td><td> PharmaDerm Tiergesundheit </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% Natriumchlorid-Injektion USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Thermokauter Einheit </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Ersatz-Spitze, gerade Feinkreis </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Schere </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% neutral gepuffertem Formalin </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Fischer </td><td> A119P-4 </td><td> Mischen Sie 426 ml Ameisensäure in 1047 ml Leitungswasser, dann fügen Sie 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Fischer </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotationsmikrotom </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Mayers Hämatoxylin </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ml </td><td></td></tr><tr><td> Gill Hämatoxylin No.1 </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Serumtrennröhrchen </td><td> BD Medizinische </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

Die Nasen-Rachen-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) bei Menschen, Nagern und anderen Säugetieren gefunden, die Immunität in den Nasennebenhöhlen 3.1 beitragen. Die NALT sind zwei parallele glockenförmige Strukturen in der Nasenhöhle oberhalb des harten Gaumens gelegen, und werden für gewöhnlich als Nebenkomponenten der Schleimhaut-assoziierten lymphatischen System 6.4 sein. Innerhalb des NALT diskrete Kammern B und T-Lymphozyten mit Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen 4,7,8 durchsetzt. Diese Zellen werden durch eine epitheliale Zellschicht mit M-Zellen, die für die Antigenerkennung verantwortlich Wiederauffindens aus den Schleimhautoberflächen der Luftwege 9,10 eingelagert sind, umgeben. Naive zirkulierenden Lymphozyten durch die NALT sind bereit, zu ersten Begegnungen mit Erregern von Atemwegsinfektionen, 7 reagieren. Während NALT beim Menschen verschwinden im Alter von zwei Jahren weiterhin den Waldeyer-Ring über ähnlich strukturierte lymphatischen Organen zu bestehen thCopyright bezüglich Lebensdauer 6. Im Gegensatz zum Menschen, Mäusen erhalten NALT während des gesamten Lebens, wodurch eine bequeme Tiermodell für die Untersuchung der Immunantwort mit Ursprung in den Nasennebenhöhlen 11. Cultures of single-Zellsuspensionen von NALT sind nicht praktikabel wegen zu geringen Ausbeuten von mononukleären Zellen. Jedoch kann NALT Biologie durch ex vivo Kultivierung des intakten Organ untersucht werden, und dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, die natürliche Gewebestruktur. Für die in vivo Studien, sind genetische Defekte Knockout-Modellen präsentiert beschränkt auf NALT derzeit nicht verfügbar wegen einer schlechten Verständnis der Entwicklungsweg. Während zum Beispiel Lymphotoxin-α-Knockout-Mäusen NALT verkümmert sind, werden die Peyer-Plaques, peripheren Lymphknoten, follikulären dendritischen Zellen und anderen lymphatischen Geweben auch in diesen genetisch veränderten Mäusen 12,13 verändert. Als Alternative zur Gen-Knockout-Mäusen, chirurgische Ablation S.ermanent eliminiert NALT aus dem Nasengang ohne Auswirkungen auf andere Gewebe. Das resultierende Mausmodell wurde verwendet, um Beziehungen zwischen NALT und Immunreaktionen auf Impfstoffe 1,3 herzustellen. Serielle Sammlung von Serum, Speichel, Nasenspülungen und Vaginalsekret ist die zum Nachweis der Grundlage der Host auf Impfungen, während Immunantworten, die direkt aus NALT durch Gewebekultur bestätigt werden kann. Die folgenden Verfahren beschreiben die Operationen, Gewebekulturen und Probenentnahme notwendig, um lokale und systemische humorale Immunantworten zu intranasal (IN) Impfung zu untersuchen.

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methoden zur Beiträge der nasopharyngealen-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) der Nasenschleimhaut und systemische Immunreaktionen von Mäusen zu untersuchen, intranasale Impfungen beschrieben. Wir zeigen einen chirurgischen Eingriff, um eine NALT-abhängige Maus-Modell zu etablieren und<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kulturen extrahiert NALT.

Überprüfung der Rolle der Nasopharynx-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) in Maus auf Impfstoffe

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K Aufrufe.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Methoden zur Beiträge der nasopharyngealen-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) der Nasenschleimhaut und systemische Immunreaktionen von Mäusen zu untersuchen, intranasale Impfungen beschrieben. Wir zeigen einen chirurgischen Eingriff, um eine NALT-abhängige Maus-Modell zu etablieren und Ex vivo Kulturen extrahiert NALT.

Serie: Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualisierung von Twitching Motilität und Charakterisierung der Rolle des<em&gt; Pilg</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...