Diese Technik erleichtert die Beobachtung synaptischer Kalziumaktivität in Echtzeit als physiologischer Parameter für die zellulären Prozesse, die dem Lernen und der Gedächtnisbildung bei Drosophila melanogaster zugrunde liegen. Durch den Vergleich neuronaler Reaktionen auf Gerüche vor und nach dem assoziativen Training können wir direkte Korrelationen zwischen synaptischer Aktivität und der Bildung der Gedächtnisspur in einzelnen Fruchtfliegen ziehen. Zur Herstellung transgener Fruchtfliegen, bei denen bestimmte Neuronen von Interesse einen genetisch kodierten Kalziumindikator über weiblich-jungfräuliche und männliche Fliegen ausdrücken, die die gewünschten GAL4- und UAS-Konstrukte tragen, und die weibliche Nachkommenschaft bis drei bis sechs Tage nach der Eklat altern.
Um eine Fliege für die Bildgebung vorzubereiten, verwenden Sie feine Zangen, um eine eisbeäsierte Fliege in eine individuell vorbereitete Bildgebungskammer zu legen. Mit einem Sezieren Mikroskop, um den Thorax und Beine in Kontakt mit den elektrischen Drähten an der Unterseite der Kammer zu positionieren, und mit dem Kopf flach liegen. Fixieren Sie die Fliege an Ort und Stelle mit klarem Klebeband, und verwenden Sie eine chirurgische Skalpellklinge, um ein Fenster im Band um den Kopf zu schneiden, so dass die Antenne bedeckt und nur der vordere Teil des Thorax ausgesetzt.
Verwenden Sie einen Insektenstift, der von konkav-konvexen Kiefern gehalten wird, um die Seiten und den Hinterkopf vorsichtig mit blauem Lichthärtungskleber zu umgeben. Und verwenden Sie eine blaue Licht emittierenDE LED-Lampe, um den Kleber einzustellen. Wenn der Kleber vollständig eingestellt ist, entfernen Sie alle verbleibenden ungehärteten Kleber von der dorsalen Oberfläche des Fliegenkopfes und bedecken Sie die freiliegende Nagelhaut des Kopfes mit einem Tropfen Ringer-Lösung.
Schneiden Sie mit einem sehr feinklingenden Stichmesser durch die Nagelhaut über das Hinterteil des Kopfes, beginnend am Ocelli und schneiden Sie jede Seite medial zu den Augen, um eine Klappe der Nagelhaut zu bilden, die leicht mit Zangen abgerissen werden kann. Entfernen Sie überschüssige Nagelhaut, die die Gehirnregion von Interesse blockieren kann und verwenden Feine Zange, um sorgfältig die dorsale Oberfläche jeder Luftröhre zu löschen, wobei darauf geachtet wird, Störungen des Hirngewebes selbst zu vermeiden. Entfernen und aktualisieren Sie die Ringer-Lösung, wenn dies erforderlich ist, um den Bereich von Gewebeablagerungen zu entfernen.
Und legen Sie eine hypodermische Geruchsabgabenadel etwa einen Zentimeter vom Kopf der Fliege, wobei Sie darauf achten, dass es nichts gibt, was die Geruchszufuhr zur Antenne behindern könnte. Verbinden Sie dann die Bildgebungskammer über die hypodermische Geruchsabgabenadel mit dem Geruchsabgabesystem. Und lassen Sie die Fliege 10 Minuten, um sich von der Anästhesie und Operation zu erholen.
Zur Visualisierung der GFP-basierten Calciumindikatoren können Sie den Laser eines Multiphotonenmikroskops, das mit einem Infrarotlaser und einem auf einem vibrationsisolierten Tisch installierten Wassertauchobjektiv ausgestattet ist, auf eine Anregungswellenlänge von 920 Nanometern einstellen und einen GFP-Bandpassfilter installieren. Scannen Sie mit dem Kurs-Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns, um die von Interesse entfernte Hirnregion zu lokalisieren. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um das Scannen nur auf den Interessenbereich zu konzentrieren, um die Scanzeit zu minimieren.
Und drehen Sie die Scanansicht so, dass das Vorderteil des Kopfes nach unten zeigt. Passen Sie dann die Framegröße auf 512 x 512 Pixel an, und wählen Sie den zu scannenden Bereich aus. Unter Berücksichtigung der berechneten Scanzeit für jeden Frame, um eine Bildrate von mindestens vier Hertz zu erreichen.
Für die geruchsbeschworene Kalziumtransientenvisualisierung initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das die Bildaufnahmesoftware mit dem Geruchsabgabeprogramm verbinden kann, und beginnen Sie 6,25 Sekunden lang mit der Messung in der Mikroskopsoftware, um einen F0-Basiswert festzulegen. Liefern Sie im Geruchsabgabesystem einen 2,5-Sekunden-Geruchsreiz, der hier durch Beleuchtung von LED-Leuchten durch das Öffnen und Schließen bestimmter Geruchsbecherventile ausgelöst wird. Gefolgt von 12,5 Sekunden Aufnahme am Ende des Geruchsoffsets.
Wiederholen Sie dann die Lieferung für ein zweites und drittes Geruchsmittel auf die gleiche Weise. Um assoziative Konditionierung in diesem Setup durchzuführen, verwenden Sie das computergesteuerte Geruchsabgabesystem, um den konditionierten Stimulus-Plus-Geruch für 60 Sekunden neben 12 90 Volt Elektroschocks zu präsentieren. Nach einer 60-Sekunden-Pause allein der konditionierte Stimulus-Minus-Geruch für 60 Sekunden ohne Stromschlag.
Messen Sie den nach dem Training evozierten Kalzium-Vergänglichkeit erneut, indem Sie das Vortraining-Geruchsstimulationsprotokoll drei Minuten nach Abschluss der Trainingsphase wiederholen. Speichern Sie dann die Bilddateien in einem geeigneten Format für eine spätere Bildanalyse. Hier repräsentativPilz Körper Ausgabe Neuron Bilder, erworben wie gezeigt kann beobachtet werden.
Die spezifische kompartifikare Expression des dHomer-GCaMP3-Sensors, die nicht in den axonalen Fächern des Neurons ausgedrückt wird, zeigt ein punktiertes Signal im dendritischen Fach. Klare, wenn auch niedrigere Amplitudengeruchsreaktionen können bei Fliegen beobachtet werden, die dHomer-GCaMp3 exdrücken, im Vergleich zu Fliegen, die zytosololische GCaMP6f exdrücken. Hier zeigen repräsentative Kalziumspuren einer einzelnen Fliege Abweichungen im Geräuschpegel und in der Amplitude, die zwischen einzelnen Präparaten erhalten werden können.
Diese Technik hat die Möglichkeit eröffnet, auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie olfaktorische Darstellungen moduliert werden und wie Gedächtnisphasen durch Konditionierung gebildet werden. Solche Experimente werden entscheidend sein, um unser Verständnis von komplexen Gehirnstrukturen wie dem Pilzkörper zu erweitern und zu charakterisieren, wie assoziative Erinnerungen über verteilte Populationen von Neuronen gespeichert werden.
