Wir sind dankbar, dass Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts; Mariana Wolfner für Diskussionen über die Ei-Aktivierung; Matt Wayland für die Bildgebung zu unterstützen; und Nan Hu für die allgemeine Unterstützung im Labor. Diese Arbeit wurde von der University of Cambridge, ISSF TTW [Gewährungsnummer 097814] unterstützt.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung für Dissection Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung. <ol><li> Nehmen Sie eine Fliege Fläschchen ca. 10 ml feste Nahrung enthält, und eine kleine Menge von Trockenhefe zu einer Ecke hinzufügen, weniger als 1 g ausreichend ist. Hinweis: Weitere Informationen über das Fliegenflaschen oder Nahrung siehe &quot;Drosophila Wartung&quot; 19. </li><li> Merken 1 - 3 Tropfen Wasser, um die Hefe zu hydratisieren. </li><li> Stellen Sie das Fläschchen beiseite zu einem Winkel von 45 ° und ermöglichen 3-5 min für die Hefe, das Wasser aufzunehmen. </li><li> Während die Hefe das Wasser absorbiert, wählen Sie eine Flasche von Fliegen UASt- myr GCaMP5 20 angetrieben durch wannen VP16GAL4 (bezeichnet als GCaMP5) zum Ausdruck , die vor kurzem entstanden sind (ein myristoyumgerechnet Form wurde der GCaMP5 durch Anbinden der GECI an die Membran in dem Ei) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen, gewählt. </li><li> Betäuben die Fliegen in der Flasche mit CO 2 -Gas. Achten Sie darauf, die Flasche umgedreht zu halten, um nicht Fliegen im Nassfutter zu verlieren. </li><li> Zünglein an der narkotisierten Fliegen auf einen CO 2 Pad und sortieren 10 bis 15 Frauen und 5 Männer mit einem Pinsel unter einem Binokular mit. Hinweis: Es ist Standard-Männchen sind gesunde Frauen für die Präparation zur Verfügung zu stellen. </li><li> Wenn das Fläschchen aus Schritt 1.3 bereit ist, fügen Sie in das Fläschchen die ausgewählten Fliegen. Achten Sie darauf, das Fläschchen horizontal zu halten, bis die Fliegen aktiv. </li><li> Legen Sie das Fläschchen bei 25 ° C für ca. 36 Std. </li><li> Lege die restlichen Fliegen aus dem CO 2 - Pad auf der Flasche oder zu verwerfen. </li></ol> 2. Präparieren Drosophila Ovarien Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al. <sbis&gt; 18. <ol><li> Nach 36 h, mit CO 2 , die Fliegen aus dem yeasted Fläschchen betäuben. </li><li> Sobald die Fliegen in der Phiole narkotisiert werden , um sie auf das Kissen CO 2 Spitze mit einem Pinsel unter einem Binokular sortiert werden. </li><li> Wählen Sie eine Frau. </li><li> Isolieren Sie die beiden Ovarien vom Weibchen. Für detaillierte und vollständige Protokoll siehe Weil et. al. 18. Zusammenfassend: <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen mit Sauerstoff angereichert Halocarbonöl (Serie 95) auf einem Nr 1.5, 22 x 40 mm Deckglas. </li><li> Fassen Sie die Frau mit einer Pinzette an der vorderen des Bauches. </li><li> das Weibchen unter dem Binokular halten, um den zweiten Satz von Zangen verwenden, um sanft den hinteren Teil des weiblichen entfernen. </li><li> Wischen Sie das hintere Gewebe aus der zweiten Zange ab. </li><li> Druck auf den Bauch Hohlraum mit dem zweiten Zange von der anterioren zum posterioren des Bauches. Die beiden undurchsichtigen Ovarien sollte die Zange halten, wenn sie außerhalb der FEMAle. </li><li> Tippen Sie auf die Ovarien in das Öl. </li><li> Entfernen Sie alle Gewebe aus der Zange durch die Zange Abwischen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte (2.4.1 - 2.4.7) drei Deck zu erhalten, mit je Ovarien von einer Fliege. </li></ol></li></ol> 3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier <ol><li> Unter einem Standard-Binokular mit der Vergrößerung 4X gesetzt, auf dem ersten Deckglas aus Schritt 2.4, trennen die beiden Ovarien durch die Eileiter reißen. </li><li> Führen Sie ein Paar geschlossene Zange in die Mitte eines einzigen Ovar, dabei keine Eikammern zu durchstechen. </li><li> Legen Sie eine Standard-Sezieren Sonde in die Mitte des Ovar neben der geschlossenen Zange. </li><li> Vorsichtig ziehen Sie das Sezieren Sonde durch den Ovarien in Richtung des hinteren Pol, wo die reifen Eier (Stufe 14 Eikammern) angeordnet sind. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,4 2 bis 5 mal je nach Größe des Eierstocks und der Anzahl der Eier. Anmerkung: Die Zugabe von CO 2 </sub&gt; verursacht typischerweise die Abscheidung eines einzigen Ei, das größer mit erhöhten Rückenanhänge als vorher entnommenes Eier erscheinen. Dieses Ei ist für die Bildgebung verworfen werden, da sie bereits in dem weiblichen aktiviert wurde. Hinweis: Ältere Eier sind wahrscheinlich leicht von ovarian Bindegewebe zu trennen. </li><li> Wenn keine reifen Eizellen außerhalb des Ovars sichtbar sind, weiterhin vorsichtig mit dem Sezieren Sonde necken. </li><li> Sobald die reifen Eier auf dem Deckglas außerhalb des Ovars sichtbar sind, manövrieren 3 bis 5 in einer Linie in der Mitte des Deckglases. Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen, die Sonde sanft an der Seite der Eier laufen. Hinweis: Vermeiden Sie auf die Rückenanhänge ziehen, da dies das Ei beschädigen können. Hinweis: Abhängig von der künftigen Abbildungsaufbau, richten Sie die Eier etwa 200 &amp; mgr; m Abstand senkrecht zur Deck für maximale Abbildungsbereich. </li><li> Einmal ausgerichtet, entfernen Sie den Rest des Ovargewebe indem sie sie weg von den ausgerichteten Eier Ziehen der f mitorceps. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Ecke eines medizinischen wischen Abtupfen. Achten Sie darauf, nicht die reifen Eier zu berühren mit der medizinischen wischen als reife Eier, die verloren werden, sind in Kontakt gebracht. </li><li> Zeichnen Sie ein Fadenkreuz auf dem Deckglas mit einem Marker unter dem Mikroskop Auffinden der Probe zu vereinfachen. </li><li> Legen Sie das Deckglas an einem sicheren Ort und lassen Sie die vorbereiteten Eikammern auf dem Deckglas für 5 ruhen - 10 min. Dies ermöglicht das Ei im Öl zu begleichen. Die Proben können bis zu 1 h nach Präparation verwendet werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,11 für den Rest der Deckgläser mit Ovarien auf ihnen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Imaging <ol><li> Bringen bereit Aktivierungspuffer 15 auf Raumtemperatur. Hinweis: Der Aktivierungspuffer ist ein hypotonischen Puffer: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% Polyethylenglykol 8000, 2 mM CaCl 2, auf pH 6,4 mit einer 1: 5-Verhältnis von NaOH: KOH.Für weitere Informationen siehe Mahowald 1983 15. Aliquots Aktivierungspuffer kann über Monate bei -20 ° C gelagert werden und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li><li> Transport sorgfältig vorbereitete Deck, Aktivierungspuffer und Glaspipetten auf die Abbildungsmöglichkeiten. Hinweis: Ein Weitfeld, konfokale kann sich drehende Scheibe oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet werden. Wir empfehlen ein umgekehrtes Mikroskop. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. </li><li> Ein Ziel für die gesamte reife Eizelle Bildgebung sollte (20x 0,7 NA hier) gewählt werden. </li><li> Montieren Sie die erste vorbereitete Deckglas auf den Mikroskoptisch. Achten Sie darauf, nicht die Deckgläser auf der Bühne zu brechen. </li><li> Qualitativ wählen ein Sichtfeld mit einer reifen Eizelle Kammer zur Aktivierung. Nicht Bild durchstochen Eikammern oder solche mit blebbing in der Membran. Hinweis: Für die Schritte 4,6-4,7, Software-Befehle in Abhängigkeit von Mikroskop und Hersteller unterschiedlich. </li><li> Set Imaging paraMeter für Standard-GFP-Anregung (488 nm) und Emission (500-580 nm). Auch eine Hellfeld-Ansicht, um die reife Eizelle und verdrängte Öl zu visualisieren und zu orientieren einzurichten. </li><li> Wählen Sie den niedrigsten Z-Ebene, wo reife Eier sind sichtbar und stellen einen vollen Z-Stapel werden für 40 &amp; mgr; m bei etwa 2 &amp; mgr; m pro Schritt getan. Stellen Sie die Parameter so gibt es keine Verzögerung zwischen den Z-Stack-Übernahme ist. Stellen Sie die Zeitreihen für ca. 30 min zu erfassen. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung <ol><li> Starten der Bildaufnahme. </li><li> Warten Sie mit 1 - 2 Badezimmer mit Z-Stapel erworben werden. Dies zeigt die reife Eizelle vor der Aktivierung. </li><li> Ziehen Sie etwa 300 ul Aktivierungspuffer in einer Glaspipette. </li><li> Positionierung der Spitze der Glaspipette enthält Aktivierungspuffer bei einem Winkel von 45 ° über dem Deckglas, bewegen sich langsam die Pipette in den Strahlengang, bis er direkt über die reife Eizelle ist abgebildet wird. Die Glaspipette solltesein, 1 bis 2 cm über dem Öl. </li><li> Hinzufügen von 1 bis 2 Tropfen Aktivierungspuffer in weniger als 5 Sekunden von der Glaspipette. Dies sollte das Öl verdrängen. Vermeiden Zugabe von überschüssigem Aktivierungspuffer oder berühren Sie das Ei mit der Glaspipette, wie es Verschiebung des reifen Eizelle verursachen kann. Achten Sie darauf, nicht das Deckglas mit der Pipette zu berühren, da dies eine Änderung in der Brennebene oder Luftblasen verursachen können im Tauchöl zwischen Objektiv und Deckglas zu bilden. </li><li> Während das Hinzufügen Aktivierungspuffer während der Bildaufnahme, überprüfen Sie das Hellfeld-Kanal, um sicherzustellen, dass das Öl durch den Aktivierungspuffer verschoben wurde. Anmerkung: Dieser wird zunächst als Schatten erscheinen aufgrund der Pipette den Strahlengang zu brechen, sondern auch in dem Auftreten von kleinen Öltröpfchen führen. Einige Öltröpfchen können mit dem reifen Ei verbunden bleiben, die experimentellen Ergebnisse und die Bildqualität beeinflussen. </li><li> Wenn das Öl nicht aus der anfänglichen Zugabe von Aktivierungspuffer Wiederholung verschoben Schritte 5,4-50,6. </li><li> Sobald das Öl erfolgreich verschoben wird, damit die Serie der Zeit bis zum Abschluss zu führen. Hinweis: Aufgrund bei Aktivierung von Eizellen zu Schwellungen, einige Eikammern der Fokusebene oder Feld dramatisch aus Sicht bei der Zugabe von Aktivierungspuffer bewegen wird. In dieser Situation, die Übernahme zu stoppen und die nächste Deck montieren. </li><li> Nachdem die Bildfolgeerfassung abgeschlossen ist, speichern Daten. </li></ol> 6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung <ol><li> Öffnen Sie den Datensatz mit Fidschi (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) oder eine gleichwertige Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie die entsprechenden Dateien für die Analyse. </li><li> Um eine Projektion der erfassten Daten bauen wählen: Bild&gt; Stacks&gt; Z-Projekt. </li><li> Wählen Sie eine Start Z-Scheibe und einen Anschlag Z-Scheibe, in der Regel den ganzen Abschnitt. Wählen Sie eine Projektionstyp, in der Regel auf &quot;Max Intensity&quot;. Überprüfen Sie Kontrollkästchen &quot;All Time Frames&quot;, um die gewählten Einstellungen für die gesamte Serie zu übernehmen. </li><li> Obmehr als ein fluoreszierendes Kanal abgebildet worden ist, die Kanäle Tool Bewegung zwischen den Farben zu ermöglichen, einen Verbund zu machen, oder das Bild Graustufen zu machen. Wählen Sie Bild&gt; Farben&gt; Kanäle Werkzeug. </li><li> Um die Bildhelligkeit ein und wählen Sie den Bildkontrast&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast. </li><li> Um ein einzelnes Bild exportieren, bewegen Zeitplan Regler nach relevanten Rahmen und wählen Sie Datei&gt; Speichern unter&gt; JPEG oder in einem bevorzugten Format. </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. Hinweis: Die Bildrate von der Imaging-Software wird benötigt, mit einem Zeitstempel auf dem Bild zu geben. </li><li> Um die Zeitreihe als Film exportieren wählen: Datei&gt; Speichern unter&gt; AVI, dann Frame-Rate wählen (~ 7 Bilder pro Sekunde). </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. </li><li> Um die eingestellte Datei in Fidschi-Format, wählen Sie Datei&gt; Speichern. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Eine Änderung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen 1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca 2+ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca 2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses. Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch 3; Ca 2+ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster 4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus 6. Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt 2+ Dynamik in vivo 7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen 8 ausgedrückt. GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca 2+ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu 9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca 2+ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca 2+ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente 9. GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium 12 extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca 2+ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca 2+ Welle bei Eiaktivierung 13,14 enthüllt. Die Ca 2+ Welle kann während des Eisprungs in vivo 13 oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay 13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung 15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde. Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca 2+ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca 2+ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca 2+ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14. Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden. In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 &amp; mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Aufrufe.  University of Cambridge.  Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila. 

Serie: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...