Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
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Wir sind dankbar, dass Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts; Mariana Wolfner für Diskussionen über die Ei-Aktivierung; Matt Wayland für die Bildgebung zu unterstützen; und Nan Hu für die allgemeine Unterstützung im Labor. Diese Arbeit wurde von der University of Cambridge, ISSF TTW [Gewährungsnummer 097814] unterstützt.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung für Dissection Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung. <ol><li> Nehmen Sie eine Fliege Fläschchen ca. 10 ml feste Nahrung enthält, und eine kleine Menge von Trockenhefe zu einer Ecke hinzufügen, weniger als 1 g ausreichend ist. Hinweis: Weitere Informationen über das Fliegenflaschen oder Nahrung siehe &quot;Drosophila Wartung&quot; 19. </li><li> Merken 1 - 3 Tropfen Wasser, um die Hefe zu hydratisieren. </li><li> Stellen Sie das Fläschchen beiseite zu einem Winkel von 45 ° und ermöglichen 3-5 min für die Hefe, das Wasser aufzunehmen. </li><li> Während die Hefe das Wasser absorbiert, wählen Sie eine Flasche von Fliegen UASt- myr GCaMP5 20 angetrieben durch wannen VP16GAL4 (bezeichnet als GCaMP5) zum Ausdruck , die vor kurzem entstanden sind (ein myristoyumgerechnet Form wurde der GCaMP5 durch Anbinden der GECI an die Membran in dem Ei) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen, gewählt. </li><li> Betäuben die Fliegen in der Flasche mit CO 2 -Gas. Achten Sie darauf, die Flasche umgedreht zu halten, um nicht Fliegen im Nassfutter zu verlieren. </li><li> Zünglein an der narkotisierten Fliegen auf einen CO 2 Pad und sortieren 10 bis 15 Frauen und 5 Männer mit einem Pinsel unter einem Binokular mit. Hinweis: Es ist Standard-Männchen sind gesunde Frauen für die Präparation zur Verfügung zu stellen. </li><li> Wenn das Fläschchen aus Schritt 1.3 bereit ist, fügen Sie in das Fläschchen die ausgewählten Fliegen. Achten Sie darauf, das Fläschchen horizontal zu halten, bis die Fliegen aktiv. </li><li> Legen Sie das Fläschchen bei 25 ° C für ca. 36 Std. </li><li> Lege die restlichen Fliegen aus dem CO 2 - Pad auf der Flasche oder zu verwerfen. </li></ol> 2. Präparieren Drosophila Ovarien Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al. <sbis&gt; 18. <ol><li> Nach 36 h, mit CO 2 , die Fliegen aus dem yeasted Fläschchen betäuben. </li><li> Sobald die Fliegen in der Phiole narkotisiert werden , um sie auf das Kissen CO 2 Spitze mit einem Pinsel unter einem Binokular sortiert werden. </li><li> Wählen Sie eine Frau. </li><li> Isolieren Sie die beiden Ovarien vom Weibchen. Für detaillierte und vollständige Protokoll siehe Weil et. al. 18. Zusammenfassend: <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen mit Sauerstoff angereichert Halocarbonöl (Serie 95) auf einem Nr 1.5, 22 x 40 mm Deckglas. </li><li> Fassen Sie die Frau mit einer Pinzette an der vorderen des Bauches. </li><li> das Weibchen unter dem Binokular halten, um den zweiten Satz von Zangen verwenden, um sanft den hinteren Teil des weiblichen entfernen. </li><li> Wischen Sie das hintere Gewebe aus der zweiten Zange ab. </li><li> Druck auf den Bauch Hohlraum mit dem zweiten Zange von der anterioren zum posterioren des Bauches. Die beiden undurchsichtigen Ovarien sollte die Zange halten, wenn sie außerhalb der FEMAle. </li><li> Tippen Sie auf die Ovarien in das Öl. </li><li> Entfernen Sie alle Gewebe aus der Zange durch die Zange Abwischen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte (2.4.1 - 2.4.7) drei Deck zu erhalten, mit je Ovarien von einer Fliege. </li></ol></li></ol> 3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier <ol><li> Unter einem Standard-Binokular mit der Vergrößerung 4X gesetzt, auf dem ersten Deckglas aus Schritt 2.4, trennen die beiden Ovarien durch die Eileiter reißen. </li><li> Führen Sie ein Paar geschlossene Zange in die Mitte eines einzigen Ovar, dabei keine Eikammern zu durchstechen. </li><li> Legen Sie eine Standard-Sezieren Sonde in die Mitte des Ovar neben der geschlossenen Zange. </li><li> Vorsichtig ziehen Sie das Sezieren Sonde durch den Ovarien in Richtung des hinteren Pol, wo die reifen Eier (Stufe 14 Eikammern) angeordnet sind. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,4 2 bis 5 mal je nach Größe des Eierstocks und der Anzahl der Eier. Anmerkung: Die Zugabe von CO 2 </sub&gt; verursacht typischerweise die Abscheidung eines einzigen Ei, das größer mit erhöhten Rückenanhänge als vorher entnommenes Eier erscheinen. Dieses Ei ist für die Bildgebung verworfen werden, da sie bereits in dem weiblichen aktiviert wurde. Hinweis: Ältere Eier sind wahrscheinlich leicht von ovarian Bindegewebe zu trennen. </li><li> Wenn keine reifen Eizellen außerhalb des Ovars sichtbar sind, weiterhin vorsichtig mit dem Sezieren Sonde necken. </li><li> Sobald die reifen Eier auf dem Deckglas außerhalb des Ovars sichtbar sind, manövrieren 3 bis 5 in einer Linie in der Mitte des Deckglases. Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen, die Sonde sanft an der Seite der Eier laufen. Hinweis: Vermeiden Sie auf die Rückenanhänge ziehen, da dies das Ei beschädigen können. Hinweis: Abhängig von der künftigen Abbildungsaufbau, richten Sie die Eier etwa 200 &amp; mgr; m Abstand senkrecht zur Deck für maximale Abbildungsbereich. </li><li> Einmal ausgerichtet, entfernen Sie den Rest des Ovargewebe indem sie sie weg von den ausgerichteten Eier Ziehen der f mitorceps. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Ecke eines medizinischen wischen Abtupfen. Achten Sie darauf, nicht die reifen Eier zu berühren mit der medizinischen wischen als reife Eier, die verloren werden, sind in Kontakt gebracht. </li><li> Zeichnen Sie ein Fadenkreuz auf dem Deckglas mit einem Marker unter dem Mikroskop Auffinden der Probe zu vereinfachen. </li><li> Legen Sie das Deckglas an einem sicheren Ort und lassen Sie die vorbereiteten Eikammern auf dem Deckglas für 5 ruhen - 10 min. Dies ermöglicht das Ei im Öl zu begleichen. Die Proben können bis zu 1 h nach Präparation verwendet werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,11 für den Rest der Deckgläser mit Ovarien auf ihnen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Imaging <ol><li> Bringen bereit Aktivierungspuffer 15 auf Raumtemperatur. Hinweis: Der Aktivierungspuffer ist ein hypotonischen Puffer: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% Polyethylenglykol 8000, 2 mM CaCl 2, auf pH 6,4 mit einer 1: 5-Verhältnis von NaOH: KOH.Für weitere Informationen siehe Mahowald 1983 15. Aliquots Aktivierungspuffer kann über Monate bei -20 ° C gelagert werden und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li><li> Transport sorgfältig vorbereitete Deck, Aktivierungspuffer und Glaspipetten auf die Abbildungsmöglichkeiten. Hinweis: Ein Weitfeld, konfokale kann sich drehende Scheibe oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet werden. Wir empfehlen ein umgekehrtes Mikroskop. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. </li><li> Ein Ziel für die gesamte reife Eizelle Bildgebung sollte (20x 0,7 NA hier) gewählt werden. </li><li> Montieren Sie die erste vorbereitete Deckglas auf den Mikroskoptisch. Achten Sie darauf, nicht die Deckgläser auf der Bühne zu brechen. </li><li> Qualitativ wählen ein Sichtfeld mit einer reifen Eizelle Kammer zur Aktivierung. Nicht Bild durchstochen Eikammern oder solche mit blebbing in der Membran. Hinweis: Für die Schritte 4,6-4,7, Software-Befehle in Abhängigkeit von Mikroskop und Hersteller unterschiedlich. </li><li> Set Imaging paraMeter für Standard-GFP-Anregung (488 nm) und Emission (500-580 nm). Auch eine Hellfeld-Ansicht, um die reife Eizelle und verdrängte Öl zu visualisieren und zu orientieren einzurichten. </li><li> Wählen Sie den niedrigsten Z-Ebene, wo reife Eier sind sichtbar und stellen einen vollen Z-Stapel werden für 40 &amp; mgr; m bei etwa 2 &amp; mgr; m pro Schritt getan. Stellen Sie die Parameter so gibt es keine Verzögerung zwischen den Z-Stack-Übernahme ist. Stellen Sie die Zeitreihen für ca. 30 min zu erfassen. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung <ol><li> Starten der Bildaufnahme. </li><li> Warten Sie mit 1 - 2 Badezimmer mit Z-Stapel erworben werden. Dies zeigt die reife Eizelle vor der Aktivierung. </li><li> Ziehen Sie etwa 300 ul Aktivierungspuffer in einer Glaspipette. </li><li> Positionierung der Spitze der Glaspipette enthält Aktivierungspuffer bei einem Winkel von 45 ° über dem Deckglas, bewegen sich langsam die Pipette in den Strahlengang, bis er direkt über die reife Eizelle ist abgebildet wird. Die Glaspipette solltesein, 1 bis 2 cm über dem Öl. </li><li> Hinzufügen von 1 bis 2 Tropfen Aktivierungspuffer in weniger als 5 Sekunden von der Glaspipette. Dies sollte das Öl verdrängen. Vermeiden Zugabe von überschüssigem Aktivierungspuffer oder berühren Sie das Ei mit der Glaspipette, wie es Verschiebung des reifen Eizelle verursachen kann. Achten Sie darauf, nicht das Deckglas mit der Pipette zu berühren, da dies eine Änderung in der Brennebene oder Luftblasen verursachen können im Tauchöl zwischen Objektiv und Deckglas zu bilden. </li><li> Während das Hinzufügen Aktivierungspuffer während der Bildaufnahme, überprüfen Sie das Hellfeld-Kanal, um sicherzustellen, dass das Öl durch den Aktivierungspuffer verschoben wurde. Anmerkung: Dieser wird zunächst als Schatten erscheinen aufgrund der Pipette den Strahlengang zu brechen, sondern auch in dem Auftreten von kleinen Öltröpfchen führen. Einige Öltröpfchen können mit dem reifen Ei verbunden bleiben, die experimentellen Ergebnisse und die Bildqualität beeinflussen. </li><li> Wenn das Öl nicht aus der anfänglichen Zugabe von Aktivierungspuffer Wiederholung verschoben Schritte 5,4-50,6. </li><li> Sobald das Öl erfolgreich verschoben wird, damit die Serie der Zeit bis zum Abschluss zu führen. Hinweis: Aufgrund bei Aktivierung von Eizellen zu Schwellungen, einige Eikammern der Fokusebene oder Feld dramatisch aus Sicht bei der Zugabe von Aktivierungspuffer bewegen wird. In dieser Situation, die Übernahme zu stoppen und die nächste Deck montieren. </li><li> Nachdem die Bildfolgeerfassung abgeschlossen ist, speichern Daten. </li></ol> 6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung <ol><li> Öffnen Sie den Datensatz mit Fidschi (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) oder eine gleichwertige Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie die entsprechenden Dateien für die Analyse. </li><li> Um eine Projektion der erfassten Daten bauen wählen: Bild&gt; Stacks&gt; Z-Projekt. </li><li> Wählen Sie eine Start Z-Scheibe und einen Anschlag Z-Scheibe, in der Regel den ganzen Abschnitt. Wählen Sie eine Projektionstyp, in der Regel auf &quot;Max Intensity&quot;. Überprüfen Sie Kontrollkästchen &quot;All Time Frames&quot;, um die gewählten Einstellungen für die gesamte Serie zu übernehmen. </li><li> Obmehr als ein fluoreszierendes Kanal abgebildet worden ist, die Kanäle Tool Bewegung zwischen den Farben zu ermöglichen, einen Verbund zu machen, oder das Bild Graustufen zu machen. Wählen Sie Bild&gt; Farben&gt; Kanäle Werkzeug. </li><li> Um die Bildhelligkeit ein und wählen Sie den Bildkontrast&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast. </li><li> Um ein einzelnes Bild exportieren, bewegen Zeitplan Regler nach relevanten Rahmen und wählen Sie Datei&gt; Speichern unter&gt; JPEG oder in einem bevorzugten Format. </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. Hinweis: Die Bildrate von der Imaging-Software wird benötigt, mit einem Zeitstempel auf dem Bild zu geben. </li><li> Um die Zeitreihe als Film exportieren wählen: Datei&gt; Speichern unter&gt; AVI, dann Frame-Rate wählen (~ 7 Bilder pro Sekunde). </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. </li><li> Um die eingestellte Datei in Fidschi-Format, wählen Sie Datei&gt; Speichern. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Eine Änderung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen 1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca 2+ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca 2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses. Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch 3; Ca 2+ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster 4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus 6. Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt 2+ Dynamik in vivo 7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen 8 ausgedrückt. GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca 2+ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu 9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca 2+ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca 2+ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente 9. GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium 12 extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca 2+ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca 2+ Welle bei Eiaktivierung 13,14 enthüllt. Die Ca 2+ Welle kann während des Eisprungs in vivo 13 oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay 13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung 15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde. Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca 2+ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca 2+ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca 2+ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14. Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden. In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 &amp; mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Aufrufe.  University of Cambridge.  Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila. 

Serie: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurowissenschaften

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Überwachung epileptiformer Ereignisse in Drosophila mittels Calcium-Bildgebung

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autor im Rampenlicht: Einblicke in die Techniken und Erkenntnisse der jüngsten Fortschritte in der Epilepsieforschung 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

Imaging Calcium in

Zusammenfassung

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Upright-Imaging von

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans