Dieses Protokoll skizziert die Produktion von immuntherapeutischen Rhesus-T-Zellen, die zwei Proteine exprimieren: einen antiviralen chimären Antigenrezeptor und einen Chemokinrezeptor CXCR5, der Zellen auf lymphoide Follikel abgezielt. Dieses relativ schnelle neuntägige Verfahren produziert T-Zellen mit weniger differenziertem zentralen Gedächtnisphänotyp mit dem Potenzial für langfristige sehnzähg nach der Infusion in Tiere. Die Anpassung dieser Methode an menschliche Zellen ermöglicht die Produktion von immuntherapeutischen T-Zellen mit dem Potenzial, eine dauerhafte Remission an HIV ohne Verabreichung antiretroviraler Medikamente zu induzieren.
Diese Methode kann allgemein verwendet werden, um Rhesus-T-Zellen zu produzieren, die andere Proteine von Interesse ausdrücken. Und mit kleineren Modifikationen, Es kann verwendet werden, um transduzierte T-Zellen in anderen Arten einschließlich des Menschen zu erzeugen. Der Erfolg der Transduktion hängt von gesunden stimulierten PBMCs ab.
Bei der Abholung, dem Transport und der Lagerung ist Vorsicht geboten. Vor der Transduktion ist es wichtig, die Stimulation der Zellen visuell zu beurteilen. Beginnen Sie mit dem Auftauen der primären Rhesus-PBMCs.
Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad mit sanfter Rührung, bis nur noch eine geringe Menge Eis übrig bleibt. Pipette der Zellen in ein konisches Rohr. Dann spülen Sie die Durchstechflasche mit einem Milliliter Basismedium und fügen Sie sie langsam zu den Zellen hinzu.
Fügen Sie den Zellen langsam weitere neun Milliliter warmes Grundmedium hinzu. Legen Sie das Rohr in den aerosolbeständigen Kanister und zentrieren Sie es bei 600 mal g für fünf Minuten bei 22 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einer kleinen Menge von Wachstumsmedium.
Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 10 Mikroliter Zellen zu 10 Mikroliter Trypanblau hinzu. Laden Sie die Kammerrutsche ein und legen Sie sie in den Zähler ein. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Zellen zu zählen.
Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen, indem Sie die Zellkonzentration mit dem Volumen multiplizieren und verdünnen Sie sie auf zwei Millionen Zellen pro Milliliter im Wachstumsmedium. Fügen Sie Anti-CD28 für eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Dann Pipette drei bis sechs Millionen Zellen pro Gut in Anti-CD3-beschichtete Platten.
Inkubieren Sie die Platten für zwei Tage bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Erwärmen Sie eine Zentrifuge auf 32 Grad Celsius, indem Sie sie etwa 30 Minuten lang bei 2.000 mal g laufen lassen. Währenddessen sowohl serumfreie als auch Wachstumsmedien in einem 37 Grad Celsius Wasserbad erwärmen und das Virus mit sanftem Wirbeln in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auftauen.
Dann legen Sie es auf Eis. Verdünnen Sie das Virus zu einer vorgegebenen optimalen Infektionsvielfalt im serumfreien Medium. Fügen Sie zwei Milliliter des verdünnten Retrovirus zu jedem Brunnen der Fibronectin-beschichteten Platte mit Medien allein für die negativen Kontrollzellen hinzu.
Die Platten in die vorgewärmte Zentrifuge in Mikroplattenträger legen und zwei Stunden lang bei 2 000 mal g zentrifugieren. Bei sofortiger Verwendung, aspirieren Sie die Viruspräparation aus den Brunnen und fügen Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium. Überprüfen Sie die stimulierten PBMCs unter einem invertierten Mikroskop.
Die Zellen sollten rund, hell und sie sollten Licht brechen. Sie sollten auch ein verklumptes Aussehen haben, das stimulationant. Sammeln Sie die Zielzellen und übertragen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre.
Spülen Sie jeden Brunnen einmal mit einem Milliliter Wachstumsmedium und fügen Sie das in die Röhre. Zählen Sie dann die Zellen wie zuvor gezeigt. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren sie bei 600 mal g für fünf Minuten bei 32 Grad Celsius.
Die Medien aus dem Pellet absaugen und die Zellen im Wachstumsmedium mit einer Konzentration von 1,5 Millionen Zellen pro Milliliter wieder aussetzen. Fügen Sie jedem virusbeschichteten Brunnen einen Milliliter der Zellsuspension hinzu und fügen Sie MAC-Transduce-Zellen zu fibronectinbeschichteten Brunnen hinzu, die kein Virus erhalten haben. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1 000 mal g für 10 Minuten bei 32 Grad Celsius und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden.
Die Arbeit mit Rhesuszellen und Gamma-Retroviren erfordert die Verwendung persönlicher Schutzausrüstungen wie Labormäntel und Handschuhe, und die Arbeit muss in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Alle Pipetten und Lösungen müssen dekontaminiert werden. Pipette den Inhalt jedes Brunnens nach oben und unten mit einer Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellen wieder aufzuhängen und sie in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen.
Fügen Sie einen Milliliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen und Pipette nach oben und unten, um anhaftende Zellen zu entfernen. Zählen Sie dann die Zellen wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 mal g für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius.
Dann die Medien ansaugen und die Zellen in Expansionsmedien auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter aussetzen. Säen Sie fünf Milliliter Zellen in jeden gasdurchlässigen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und schichten Sie vorsichtig weitere 25 Milliliter Expansionsmedien pro Brunnen. Dann inkubieren Sie die Zellen ungestört bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier Tage.
Um die Zellen aus den Brunnen zu sammeln, entfernen und entsorgen Sie 20 Milliliter der Medien, die darauf achten, die Zellen nicht zu stören. Pipette die verbleibenden Medien nach oben und unten, um die Zellen zu vertreiben. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um jeden Brunnen mit drei Millilitermedien zu spülen und die Restzellen zu sammeln.
Zählen Sie sie dann, um die Zellennummer und Lebensfähigkeit zu überprüfen. Dieses Protokoll wurde für die Transduktion und Erweiterung von Zellen von sechs verschiedenen Tieren verwendet. Gasdurchlässige Brunnen wurden mit einer Anfangsdichte von fünf Millionen Zellen ausgesät und nach vier Tagen Wachstum wurde eine mittlere Dichte von 55,6 Millionen Zellen pro Brunnen erreicht.
Die Lebensfähigkeit der zellen, die durch Trypan-Blau-Ausschluss überwacht wurden, wurde während des gesamten Protokolls bei 83 bis 95 % gehalten. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Koexpression der transduzierten Gene zu beobachten. Am fünften Tag wurden ein Median von 42,8 % der Zellen sowohl mit CD4-MBL CAR als auch mit CXCR5 transduziert.
Während am neunten Tag betrug der Medianausdruck 47,6 % bei einer einzigen Transduktionsrunde. Durchflusszytometrie wurde auch verwendet, um Speicher-Phänotyp zu überwachen. Vor der Transduktion und Expansion wurden naive zentrale Gedächtnis- und Effektorgedächtnispopulationen identifiziert.
Die naive Population ging mit der Kultivierung verloren und die Zellen waren in erster Linie zentrale Gedächtniszellen am fünften tag und am neunten Tag. Der Erfolg der Transduktion hängt von der Verwendung hochwertiger Reagenzien, hochlebensfähiger Zellen und titrierter Viren sowie der konsequenten Befolgung des Timings des Protokolls ab. Die Zellen können für funktionelle Assays einschließlich Migrations- und Virussuppressions-Assays sowie für die Infusion in Tiere für präklinische Studien verwendet werden, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu testen.
Wir haben die präklinischen Tests von CAR- und CXCR5-T-Zellen an Tieren vorangetrieben und hoffen, diese Immuntherapie bald bei HIV-infizierten Personen testen zu können.
