Die Autoren bedanken sich bei Kelly A. Burke für die technische Unterstützung danken, mit ACC Untergrundvorbereitung. Basierend auf den Artikel Biomaterialien veröffentlicht, Davis KA, et al, Dynamic Verhaltens von Zellen auf Formgedächtnispolymer Substrate, Biomaterialien, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Dieses Material ist auf der Arbeit von NSF unter Grant No DMR-0907578 unterstützt werden.

1. Isotherme UV-Härtung von NOA63 <ol><li> Eine benutzerdefinierte Trockenkammer wurde mit einem Objektträger aus Glas (75 mm x 25 mm x 1 mm), eine 1 mm dicke Teflon Spacer und einer Aluminium-Platte (75 mm x 25 mm x 3 mm), wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Kammer wird zusammen mit kleinen Binder Clips gehalten. </li><li> Spritzen Sie die NOA63 in die Kammer durch ein Loch in die Teflon spacer mit einer 18-Gauge-Nadel. Die NOA63 schonend erhitzt werden, um Injektion zu erleichtern. </li><li> Setzen Sie die Kammer auf einer Heizplatte bei 125 ° C eingestellt und lassen auf eine einheitliche Temperatur für 5 min erhitzen. </li><li> Pre-Heilung der NOA63 in einer UV-Lampe Kammer (λ max = 365 nm, siehe Tabelle) für 20 min mit der Lampe 6,5 cm von der Oberfläche des Glases. </li><li> Entfernen Sie die NOA63 aus der Kammer, während warme mit einer Rasierklinge. </li><li> Post-Heilung der NOA63 unter dem UV-Licht für 3 h 40 m auf der Heizplatte bei 125 ° C. </li><li> Bewahren Sie die NOA63 bei -20 ° C getrocknet </li></ol> 2. Shape Memory Charakterisierung von NOA63 <ol><li> Bereiten Sie eine Hantel Probe durch Heißpressen einer gehärteten NOA63 Film mit einer kundenspezifischen Stanze (siehe Tabelle), deren Abmessungen sind in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Legen Sie die Probe in eine dynamisch-mechanischen Analysator (DMA, siehe Tabelle) mit Zug-Vorrichtung. Stellen Sie das Gerät auf &quot;Kraft gesteuert&quot;-Modus, dann Programm das Testverfahren wie folgt: <ol><li> Äquilibrieren bei 95,00 ° C </li><li> Isotherme für 10,00 min </li><li> Ramp Kraft 0,300 N / min bis 2.500 N </li><li> Isotherme für 5,00 min </li><li> Ramp 2,00 ° C / min bis 20,00 ° C </li><li> Isotherme für 10,00 min </li><li> Ramp Kraft 0,300 N / min bis 0.015 N </li><li> Isotherme für 5,00 min </li><li> Ramp 2,00 ° C / min bis 95,00 ° C </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2-9 noch zwei weitere Male </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung von Active Zellkultursubstraten <ol><li> Einzelne Proben aus dem isotherm geheilt SMP Film hergestellt werden. Schneiden Sie die SMP-Film mit einer Rasierklinge auf die gewünschte Stichprobengröße. Legen Sie die SMP auf einer heißen Platte bei einer Temperatur höher als die T g gesetzt mit dem Modul zu reduzieren und einfache Schneiden. </li><li> Die temporäre Form kann in einer Reihe von verschiedenen Arten fixiert werden. Hier verwenden wir ein Tischgerät hydraulische Presse mit beheizten / gekühlten Platten in ein temporäres Topographie prägen. Stellen Sie die Temperatur der Platten bei einer Temperatur oberhalb des T g. </li><li> Ein Braille wurde von Härtet auf einer Schallplatte gemacht. Dadurch wird eine temporäre Form von parallelen Rillen. Hier hatten die embosser Dreieckpeaks 35 bis 40 mu m hoch und 60 pm breit, im Abstand von 80 um auseinander. Der Drucker kann aus anderen Materialien und mit unterschiedlichen Topografien gemacht werden, sondern muss steifer als NOA63 am Prägetemperatur. Legen Sie die SMP Proben Gesicht nach unten auf den Drucker und legen Sie die Proben und Braille in der Presse. </li><li> Apply a ~ 100 kPa Vorspannung um den Kontakt zwischen den Heizplatten und die Proben machen und halten für ca. 5 Minuten, bis die Proben auf eine gleichmäßige Temperatur zu erreichen. </li><li> Bewerben 1-6 MPa zu den Proben und halten Sie für 1 Minute. Eine Belastung von 4,7 MPa führt zu einer unvollständigen Replikation des Druckers Topographie. Die temporäre Topographie hervorgebracht hat Spitzen von 25 bis 35 mu m hohe und 150 um breit abgerundet. Die SMP wird Fraktur, wenn eine größere Belastung angewendet wird. Übernehmen kleinerer Belastungen Topographien mit kleineren Amplituden einzuführen. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur unterhalb der T g. Hier verwenden wir die Wasserkühlung Fähigkeit der Pressplatten. </li><li> Wenn die Temperatur unterhalb der T g ist, entfernen Sie die angelegte Kraft. </li><li> Die Proben sind ausgetrocknet bei -20 ° C werden Wenn unter diesen Bedingungen gelagert, haben wir weniger als eine 1 um Abnahme der Amplitude Erholung nach zwei Monaten für die Proben mit eingeprägtem Schallplatte embosser beobachtet. </li></ol> 4. Aktive Cell Culture Experiment <ol><li> Das UV-Licht einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) wird verwendet, um die Proben zu sterilisieren. Ordnen Sie die Proben dem Gesicht nach unten in sterile Schalen ohne Deckel und schalten Sie den BSC UV-Licht für 6 h </li><li> Flip-Proben, neue sterile Gerichten offen. Schalten Sie den BSC UV-Licht für 6 h </li><li> Die Proben müssen nun ins Gleichgewicht gebracht werden, um einen relativ stabilen Zustand vor dem Ausplattieren mit Zellen. Legen Sie die Proben in einem 96-Well-Platte und fügen 150 ul komplettem Wachstumsmedium. </li><li> Legen Sie die Platte in einem 30 ° C Inkubator mit 5% CO 2 bis zum Erreichen der gewünschten teilweisen Erholung. Hier verwenden wir 30 h Proben mit groß genug Amplitude Zellen ausrichten zu produzieren. </li><li> Die Proben können nun mit Zellen beschichtet werden. Legen Sie die Proben in eine neue 96-Well-Platte. </li><li> Add 150 ul Zell-Lösung zu den Proben. Hier verwenden wir C3H/10T1/2 embryonalen Maus-Fibroblasten mit 20.000 Zellen / ml zu isolierten Zellen (in der Regel nicht in Kontakt mit anderen Zellen) zu erreichen. </li><li> Um die Zellen zu befestigen und zu verbreiten über die vorübergehende Topographie, in einem 30 ° C Inkubator für 9,5 h </li><li> Um Assay Zelle Morphologiegie vor dem Übergang, entfernen Proben und führen Färbung und Fluoreszenz-Bildgebung der Proben. Dieses Material weist durch die meisten der UV-und sichtbaren Bereich Autofluoreszenz. Fluorophore im hohen roten Ende des Spektrums, wie Alexa Fluor 647 werden empfohlen, um Hintergrund zu reduzieren. </li><li> Zum Auslösen Proben zu erholen, bewegen Sie die Platte um 37 ° C Inkubator und die Kultur für 19 h, um das Material zu erholen und damit die Zellen ihrer Morphologie auf die neue Topographie anpassen können. </li><li> Nehmen Sie Proben und Anwendung geeigneter Färbung (Phalloidin für filamentöse Aktin Bildgebung) und bildgebende Verfahren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ausgehärtete NOA63 ist eine transparente, glasartige Feststoff, der ausgezeichnete Formgedächtniseigenschaften wie in Abbildung 3 gezeigt hat. In diesem Fall wurde das Material wie im Protokoll Nr. 1 über ausgehärtet und zeigt eine gleichmäßige T g von 51,1 ° C (ermittelt aus dem Beginn der E &#39;drop). Es ist aus der Einbahnstraße Formgedächtnis-Zyklen (Heizung, Verformen, Kühlung, erholt, Abbildung 3), dass ein großer Prozentsatz der Belastung nach dem Entladen bei 20 ° C wurde behoben, das entspricht einer Fixierung Verhältnis 15 (R f) von 89,3 beobachtet % (gemittelt über drei Zyklen, das gleiche unten R r). Der feste Stamm wieder auf eine Erholung Verhältnis (R r) von 84,4% in einem relativ kleinen Temperaturbereich während der Erwärmung. Darüber hinaus zeigte die Form-Gedächtnis Leistung keine Verschlechterung von bis zu drei Zyklen, in die alle Kurven fast genau folgen aufeinander. NOA63 wurde in diesem Protokoll verwendet, weil es leicht beim Hersteller erhältlich ist und geliefert als leicht geheilt lösemittelfreie Prepolymer mit Photoinitiator. Allerdings ist seine Zusammensetzung nicht durch den Lieferanten weitergegeben. Es wurde festgestellt, dass hohe Zelladhäsion und Lebensfähigkeit zu ermöglichen. Schließlich könnte die Sprungtemperatur abgestimmt, um eine sinnvolle Größenordnung der Erholung zwischen zwei Zellen verträglichen Temperaturen zu ermöglichen. Eine Reihe von anderen Polymer-Systeme können auch mit diesem Protokoll verwendet werden, wenn die Sprungtemperatur ist kompatibel mit Zellkultur und wenn sie zu fördern Zelladhäsion und Lebensfähigkeit. Die Amplitude der temporären Topographie (Rillen) nimmt mit der Zeit bei 30 ° C. Mit 30 h bei 30 ° C, hat die Amplitude von ~ 50% (Abbildung 4, Zeit 0) 16 reduziert worden. Es reduziert die anderen 10% über die nächsten 9,5 h Als Erholung ist durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C ausgelöst, reduziert die Amplitude auf 0,5% des ursprünglichen Amplitude innerhalb von 9,5 h Für den Drucker eingesetzt und eine Prägung Stress von 4,9 MPa, dies entspricht einer funktionellen Veränderung von 13 um Nuten zu einer nahezu ebenen Fläche. Ein Beispiel für ein Verhalten der Zelle durch den Einsatz von aktiven Zellkultursubstraten gesteuert wird eine Änderung in Zytoskelett-Organisation. Auf temporäre gerillten Substraten vor der Verwertung ausgelöst wird, richten Sie die Aktin-Mikrofilamente entlang der Richtung der Rillen (Abbildung 5a) 16. Nach der Erholung von der Temperatur zu erhöhen, haben die Mikrofilamente reorganisiert und sind zufällig orientiert. Kontrollproben, die statische Rillen oder eine statische ebene Oberfläche haben, nicht nach der Erhöhung der Temperatur (Abb. 5b, c) zu reorganisieren. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1: Schematische für NOA63 Trockenkammer. Querschnitt (links) und top-down Ansicht ohne Glasabdeckung (rechts). <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2: Die Hantel Geometrie für Bulk-Form-Gedächtnis Charakterisierung W:. Breite des schmalen Abschnitt L: Länge des schmalen Abschnitt G: Messlänge, WO: Gesamtbreite, LO: Länge über alles, D: Abstand zwischen Griff, R: Radius von Filet und RO: Außenradius. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3: Der Großteil one-way Formgedächtnis einer einzigen NOA63 heilen, 3 mal wiederholt (das Sternchen zeigt experimentelle onset). An der Stelle, die mit einem Stern bezeichnet, hat das Polymer erhitzt und dann verformt, indem eine Spannung an seiner temporären Form zu definieren. Dieser Stamm wird konstant gehalten, und die Temperatur sank auf die temporäre Form unterhalb der T g des Polymers zu beheben. Anschließend wird die Temperatur erhöht, und das Material wieder zu seiner permanenten Form als temporäre Belastung wird reduziert. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4: SMP Erholung kann unter Zellkultur-kompatible Temperaturen ausgelöst werden. Die Amplitude von 25,6 ± 0,8 &amp;mgr; präsentieren folgende Prägung recovered auf 12,6 ± 1,5 um nach 30 h Äquilibrierung bei 30 ° C (Zeitpunkt 0, schwarze Kreise). Nachdem die Proben auf eine 37 ° C Inkubator (9,5 h) bewegt wurden, erholten sich die Amplitude auf 1,1 ± 0,2 um innerhalb von 3,5 h Die Amplitude wieder auf ~ 0,3 ± 0,1 um innerhalb von 9,5 h und keine nachweisbaren Rückgang in den letzten 9,5 h beobachtet wurde (rote Dreiecke). Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung (n = 4-6). Die Spuren sind, kontaktieren Sie Profilometrie Scans von repräsentativen Stichproben. <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5: Cell Aktin-Zytoskelett ordnet folgende topographische Übergang a, konfokale Aufnahmen von Zellen mit Phalloidin auf geprägtem Substrate gefärbt zeigen Mikrofilamente mit Nut-Richtung (weißer Pfeil) vor dem Übergang und Temperaturanstieg ausgerichtet.. Nach Übergang Mikrofilamente umgestellt haben, sind zufällig orientiert. B, Zellen auf flachen Substraten Kontrolle zufällig orientierten Mikrofilamente zeigen vor und nach der Temperatur zu erhöhen. C zeigen Cells auf gerillten Kontrolle Substrate Mikrofilamente mit Nut vor und nach Temperaturerhöhung ausgerichtet. Scale-Bar ist 100 um. Die Spuren sind wie in Abbildung 4.

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Die T g NOA63 kann leicht über die Härtungstemperatur gesteuert werden. Wir nutzten diese zu SMP Substrate, die in einer Zelle kompatibel Bereich ausgelöst werden kann, zu generieren. NOA63 durch Wasser, das die trockene T g senkt plastifiziert, so steigerten wir das trockene T g durch Härtung bei 125 ° C auf dem nassen Tg Bereich zwischen 30 und 37 ° C bewegen Die aktive Zellkultursubstraten nachgewiesen werden können, das Verhalten der Zelle steuern....

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes oder Instrument </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> NOA63 </td><td> Norland Products Inc. </td><td> NOA63 </td><td> Lot Nummer 111 </td></tr><tr><td> Dogbone Punsch </td><td> TestResource, Inc. Shakopee, MN </td><td></td><td> Herabgestufter Typ IV Hundeknochen (ASTM D638-03) </td></tr><tr><td> Benchtop Hydraulische Presse </td><td> Schnitzer </td><td> 3851 </td><td></td></tr><tr><td> C3H10T1 / 2 Maus embryonalen Fibroblasten </td><td> ATCC </td><td> CCL-226 </td><td></td></tr><tr><td> Biologische Sicherheitswerkbank </td><td> Thermo Fisher </td><td> 1357 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Lampe </td><td> Spectroline </td><td> SB-100PC </td><td></td></tr><tr><td> Dynamische Mechanische Analyse (DMA) </td><td> TA Instruments, Inc. </td><td> Q800 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted Fluoreszenz-Mikroskop </td><td> Leica </td><td> Leica DMI 4000B </td><td></td></tr><tr><td> Die konfokale Laser Scanning Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> 20x/0.8 NA Luft oder ein 40x/1.30 NA Öl-Objektiv </td></tr></tbody></table>

shape memory polymers for active cell culture

Formgedächtnis-Polymere (SMP) sind eine Klasse von &quot;smart&quot; Materialien, die Fähigkeit, aus einem festen, temporäre Form zu einem vorher festgelegten permanente Form nach der Anwendung eines Reizes wie Hitze 1-5 ändern. In einer typischen Form-Gedächtnis-Zyklus ist der SMP zunächst auf eine erhöhte Temperatur, die höher als seine Sprungtemperatur T trans [entweder die Schmelztemperatur (T m) oder der Glasübergangstemperatur (T g)] ist verformt. Die Verformung ist elastisch in der Natur und vor allem zu einer Reduktion in Konformationsentropie der konstituierenden Netz-Ketten (nach dem Gummielastizität Theorie). Die deformierte SMP wird dann auf eine Temperatur unterhalb seines T trans abgekühlt unter Beibehaltung der äußeren Belastungen oder Stress konstant. Beim Abkühlen des Materials Übergänge zu einer starren Zustand (semi-kristallinen oder glasartigen), die kinetisch-Traps oder &quot;friert&quot; das Material in diesem Zustand niedriger Entropie führt zu makroskopischen Form Befestigung. Shape-Erholung ist durch eine kontinuierliche Erwärmung des Materials durch T trans unter einen stressfreien (unbeschränkt) Zustand ausgelöst. Indem das Netzwerk-Ketten (mit wieder gewonnener Bewegungsfreiheit), um ihre thermodynamisch begünstigt, maximal Entropie Zustand, das Material von der temporären Form in die permanente Form zu entspannen. Die Zellen sind in der Lage Vermessung der mechanischen Eigenschaften der sie umgebenden Umwelt 6. Die Mechanismen, durch die mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer physischen Umgebung zu kontrollieren das Verhalten der Zelle sind Bereiche der aktiven Forschung. Substrate definierter Topographie sind als leistungsfähige Werkzeuge in der Untersuchung dieser Mechanismen entstanden. Mesoscale, mikro-und nanoskaligen Strukturen von Substrat Topographie haben gezeigt, dass Zellausrichtung, Zelladhäsion und Zell Zugkräfte 7-14 direkt. Diese Ergebnisse haben das Potenzial für Substrat Topographie zu kontrollieren und Test der mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer physischen Umgebung während der Zellkultur unterstrichen, aber die verwendeten Substrate bis dato wurden in der Regel passiv und konnte nicht so programmiert werden, erheblich verändern während der Kultur werden. Diese physikalische Stase hat das Potenzial, topographische Substrate, um Zellen in Kultur-Steuerung begrenzt. Hier werden aktive Zellkultur (ACC) SMP Substrate eingeführt, beschäftigen Oberflächenform Speicher programmierte Steuerung der Substrat Topographie und Verformung. Diese Substrate die Fähigkeit nachweisen, um den Übergang von einem temporären gerillten Topographie auf eine zweite, fast flach auswendig Topographie. Diese Änderung in der Topographie kann verwendet werden, um das Verhalten der Zelle unter Standard-Zellkultur-Bedingungen zu kontrollieren.

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Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Eine Methode zur Entwicklung Zellkultursubstraten mit der Fähigkeit zur Topographie während der Kultur ändern beschrieben. Die Methode nutzt intelligente Materialien wie Formgedächtnis-Polymere, die die Fähigkeit, eine permanente Form auswendig gekannt haben. Dieses Konzept ist anpassungsfähig zu einer breiten Palette von Materialien und Anwendungen.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Aufrufe.  Syracuse Biomaterials Institute. Eine Methode zur Entwicklung Zellkultursubstraten mit der Fähigkeit zur Topographie während der Kultur ändern beschrieben. Die Methode nutzt intelligente Materialien wie Formgedächtnis-Polymere, die die Fähigkeit, eine permanente Form auswendig gekannt haben. Dieses Konzept ist anpassungsfähig zu einer breiten Palette von Materialien und Anwendungen.

Serie: Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect &#8220;self-fitting.&#8221; In this way, following exposure to warm saline (~60 &#186;C), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 &#186;C) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Fabrication of a Bioactive, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Scaffold

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Herstellung eines bioaktiven, PCL-basierte &quot;Self-Montage&quot; Formgedächtnispolymer Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...