Die klassische Methode, bei der Membranproteine für ihre Studie extrahiert werden, ist die einfache Löslichkeit im Waschmittel. Während dies eine einfache und universelle Methode bietet, haben Waschmittel gezeigt, dass die native Struktur, Funktion und Aktivität dieser empfindlichen Proteine zu verändern. Hier stellen wir die Peptidisc als Lösung zur Stabilisierung von Membranproteinen in waschmittelfreier Lösung vor.
Das Peptidisc-System passt sich spontan der Größe, Form und Typologie unzähliger Membranproteine an. Dies steht im Gegensatz zu anderen Membran-Mimetiken, die oft mühsam optimiert werden müssen. FhuA, ein E.coli-Outer-Membranprotein, wird als Modellzielprotein verwendet, das in diesem Protokoll rekonstituiert werden soll.
Äußere Membranbläschen werden isoliert, gefolgt von der Zugabe von Reinigungsmittel, um die Membranproteine zu saugen. Das Peptidisc-Peptid wird der Löslichkeit zugesetzt und Waschmittel wird abgeschwächt, was spontan Peptidisc-Partikel bildet. Diese stabilisierten löslichen Partikel sind nun für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen zugänglich.
Dieses Protokoll wird die Bioschicht-Interferometrie als Anwendung der Peptidisc-Technologie untersuchen. Dieses Protokoll wird sich auf die PeptiQuick Rekonstitutionsmethode konzentrieren, eine nützliche Technik, die die gleichzeitige Reinigung und Rekonstitution von Membranproteinen erleichtert. Die PeptiQuick-Methode der On-Perlen-Rekonstitution wird in einer Standard-Nickel-NTA IMAC-Schwerkraftsäule durchgeführt, die in Waschmitteln vorausgeglichen wird.
Die lösliche Membran wird auf das Harz geladen und Nichtzielproteine weggespült. Nach diesem Peptid wird der Säule zugesetzt und das Waschmittel wird schnell verdünnt. Die hydrophobe Seite des Peptidisc-Peptids assoziiert sich mit den exponierten hydrophoben Regionen.
Die hydrophile Seite des Peptids hält das Protein in Lösung löslich. Überschüssiges Peptid wird weggewaschen. Imidazol wird hinzugefügt, um die rekonstituierte Wut zu elute.
Das Peptidisc-Gerüst kann funktionalisiert werden, um Speicherproteine indirekt zu kennzeichnen und so die Tür zu einem breiteren Satz nachgelagerter Analysen zu öffnen. Hier nutzen wir das biotinylierte Peptid zur Befestigung an Streptavidin-beschichteten Sensoren für die BLI-Analyse. Bioschicht-Interferometrie ist eine leistungsstarke etikettenfreie Technik zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen in Lösung.
Diese Technik demonstriert nicht nur nur Interaktionen, sondern ermöglicht auch eine kinetisches Echtzeit-Auslesen und ermöglicht die Berechnung einer Bindungsdissoziationskonstante. Durch dieses Protokoll eliminieren wir die Notwendigkeit von Reinigungsmitteln während der BLI-Analyse, da dies die Aktivität verändern kann. Die Biolayer-Interferometrie analysiert die Interferenzdurchfahrt von weißem Licht, das vom Sensor reflektiert wird, oder spitze, und gebundenen Makromolekülen während einer Interaktion.
Um die Wechselwirkungen zu messen, wird die Sinnesspitze zwischen Lösungen und dem bei jedem Schritt aufgezeichneten Signal übergeben. Jeder Tipp gibt dann seine eigene Spur auf einem Sensogramm. Zunächst wird nur eine Basislinie des Puffers festgelegt.
Zweitens ist der Liganden gebunden. In diesem Fall bindet FhuA und biotinylierte Peptidiscs eine Streptavidin-beschichtete Spitze. Als nächstes wird die Spitze im Puffer gewaschen, um ungebundene FhuA zu entfernen.
Nun wird die Spitze in eine Lösung mit einer bekannten Konzentration von Analyt bewegt, hier ColM. Wenn eine Interaktion auftritt, wird eine Bindungskurve angezeigt. Schließlich wird die Spitze in den Puffer verschoben und die Dissoziation gemessen.
Die beobachteten Assoziations- und Dissoziationsraten bei jeder Spaltenkonzentration können zur Berechnung der Dissoziationskonstante verwendet werden. Hexahistidin mit fhuA-Tag wird in E-coli-Stamm AW740 für 18 Stunden in Aminmedien exprimiert. Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 5 000 G 10 Minuten bei vier Grad Celsius geerntet.
Das resultierende Zellpellet wird im TSG-Puffer wieder aufgehängt und dann abgelassen, um Zellklumpen aufzubrechen und eine gründliche Lyse zu gewährleisten. TMSF wird den wieder suspendierten Zellen zu einer Endkonzentration von einem Millimolar kurz vor der Lyse hinzugefügt. Die Zelllyse wird durch drei Passagen entweder durch einen Mikrofluidisierer bei 15.000 PSI oder eine französische Presse bei 8 000 PSI erreicht.
Die lysierten Zellen werden gesammelt und eine Niedrige-Geschwindigkeit-Zentrifugation bei 5 000 G es für 10 Minuten bei vier Grad durchgeführt. Ein Überstand aus dem Langsamgeschwindigkeitsspin wird in einen TI70-Ultrazentrifugenrotor geladen und bei 200 000 G es 40 Minuten bei vier Grad zentrifugiert, um die rohe E.coli-Membran zu pellet. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand verworfen und das Rohmembranpellet in einer minimalen Menge TSG-Puffer wieder aufgehängt.
Eine rohe Membran wird abgesprungen, um ihre Homogenität zu gewährleisten. Ein Bradford Assay wird durchgeführt, um die Proteinkonzentration der wieder suspendierten Rohmembran zu überprüfen. Der TSG-Puffer wird verwendet, um die Rohmembran vor der Löslichkeit auf etwa drei Milligramm pro Milliliter zu verdünnen.
Triton X-100 wird der wieder suspendierten Rohmembran mit einer Endkonzentration von 1% zugesetzt, um die bakterielle innere Membran selektiv zu saugen. Die Löslichkeit erfolgt eine Stunde lang bei vier Grad, mit sanftem Schaukeln. Die unlösliche äußere Membran wird durch Ultrazentrifugation bei 200 000 G es für 40 Minuten bei vier Grad isoliert.
Der resultierende Überstand, der die lösliche Innenmembran enthält, wird verworfen. Während das Pellet, das die äußere Membran enthält, wie zuvor in der TSG wieder aufgehängt wird. LDAO wird einer Endkonzentration von 1% auf die wieder aufgehängte äußere Membran hinzugefügt und für eine Stunde bei vier Grad aufbereitet.
Schließlich wird wie bisher eine Ultrazentrifugation für inlösliches Pelletmaterial durchgeführt. Der resultierende Überstand enthält lösliche äußere Membran, einschließlich unseres Ziels, seines mit Tags versehenen FhuA, das nun für die gleichzeitige IMAC-Reinigung und Peptidisc-Rekonstitution bereit ist. Eine Nickel-NTA IMAC-Schwerkraftsäule wird mit zwei Säulenvolumen IMAC-Waschpuffer vorausgeglichen.
Imidazol wird in einer Endkonzentration von fünf Millimolaren der löslichen äußeren Membran zugesetzt, verdünnt auf 0,04%LDAO. Die lösliche Außenmembran wird auf das Nickel-NTA-Harz geladen und der Durchfluss gesammelt. Dieser Durchfluss wird auf das Harz reloaded, um die Harzbindung von FhuA zu erhöhen.
Nach dem Beladen wird das Harz mit 250 Milliliteri IMAC-Waschpuffer gewaschen und die ersten 50 Milliliter gesammelt. Nach dem Waschen wird der Waschpuffer knapp über die Höhe des Harzbettes abgelassen und der Säulenhahn geschlossen. Ein Milliliter konzentriert, 10 Milligramm pro Milliliter, Peptidisc Peptid wird der Spalte hinzugefügt.
Nach zugabe von konzentriertem Peptid, 50 Milliliter verdünnt, ein Milligramm pro Milliliter, Peptidisc Peptid in TSG wird hinzugefügt. Das Harz wird gerührt, um die Perlen in TSG, unterhalb des CMC von LDAO, wieder aufzuhängen und so Peptidisc-Partikel zu bilden. Nach dem Peptidisc-Fang darf sich das Harz absetzen und die Ein Milligramm pro Milliliter Peptidlösung wird durch das Harz abgelassen.
Das Harz wird mit 50 Milliliter TSG gewaschen, um überschüssiges Peptidisc-Peptid zu entfernen. Schließlich werden die Peptidisc-Partikel mit 50 Millilitern 600 Millimolar-Imidazol in TSG verdünnt. Es werden eine Milliliter-Fraktion gesammelt und 10 Mikroliter 0,5-Mol-EDTA zugegeben, ein schlüsselweises, leicht ausgelaugtes Nickel.
Der Start, der Durchfluss, das Waschen und die ausgelaufenen Fraktionen werden auf ein 12%SDS-Gel geladen und 30 Minuten lang mit 60 Milliampere elektrophoreziert. Das Gel ist auf einem Gelscanner gebeizt und visualisiert. Das resultierende Gel zeigt eine Erschöpfung von FhuA im Durchfluss und eine Anreicherung in der Elution.
Kleinere Schadstoffbänder werden auch in den ausblendeten Fraktionen beobachtet. Die Fraktionen drei bis sieben werden für die Größenausschlusschromatographie ausgewählt, um die Löslichkeit von FhuA Peptidisc zu bestätigen und Verunreinigungen zu abbauen. Ein 30 Kilodome abgeschnittenzentrifugal konzentrator wird verwendet, um Fraktionen drei bis sieben zu konzentrieren.
Ein Milliliter der gepoolten IMAC-Elusionsfraktionen wird in die S200-Säule mit einer Durchflussrate von 0,25 Milliliter pro Minute im TSG-Puffer injiziert. Ein Milliliter Fraktionen werden gesammelt und ein 12%SDS-Gel der Fraktionen ausgeführt. Die relevanten Fraktionen werden gebündelt und können nun in nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden.
BLI wurde in einem ForteBio Oktett RED96 durchgeführt. Dieses Instrument bewegt BLI-Pins über eine 96-Well-Platte, die zuerst von Hand aufgestellt wird. Alle Brunnen werden auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern gefüllt.
Spalte eins ist mit einem Kinetikpuffer geladen, damit die Spitzen ausgeglichen werden und ein Basissignal bilden können. Spalte zwei wird mit einer vorgegebenen Konzentration des Liganden- und Kinetikpuffers belastet. In diesem Fall ist FhuA der Liganden und wird der Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zugesetzt.
Die Spitze in Zeile E wird als Referenz verwendet und nur mit Puffer geladen. Spalte drei ist mit Kinetikpuffer geladen, um überschüssiges FhuA von der Spitze zu waschen. Zweifache serielle Verdünnungen des Analyten, in diesem Fall ColM, werden in Spalte 4 von oben nach unten geladen.
Die höchste dieser Konzentrationen wird für die Referenzreihe verwendet, um die unspezifische Bindung des Analyten an die Spitze zu messen. Spalte 5 wird mit Puffer geladen. Hier wird der ColM sich distanzieren und die Dissoziation gemessen.
Sobald die Platte vorbereitet ist, werden die Sensor-Spitzenschale und die vorbereitete Platte in das BLI-Instrument geladen. Die BLI Datenerfassungssoftware wird geöffnet und ein neues kinetisches Experiment gestartet. Die Registerkarte Plattendefinition wird verwendet, um das Layout der 96-Well-Platte in die Software einzugeben.
Hier wird der Ligand FhuA als Last eingegeben, während der Analyt ColM als Sample eingegeben wird. Die Registerkarte Assay Definition wird verwendet, um die Länge der Zeit und die Plattendrehzahl für jeden Schritt im Experiment zu definieren. Hier enthalten wir einen Basisschritt von 60 Sekunden, gefolgt von einem Ladeschritt von 250 Sekunden, einem zweiten Basisschritt von 300 Sekunden, einem Analytenzuordnungsschritt von 450 Sekunden und schließlich einem Dissoziationsschritt von 900 Sekunden.
Diese Schritte werden jeder Spalte in der 96-Well-Platte individuell zugewiesen, indem Sie den gewünschten Schritt auswählen und mit der rechten Maustaste auf den Test hinzufügen in jeder Spalte klicken. Die Sensorbelegungsregisterkarte wird verwendet, um sicherzustellen, dass das Oktett-Instrument BLI-Pins von der richtigen Position im Sensorfach nimmt. Die Registerkarte "Experiment überprüfen" bietet einen endgültigen Überblick über das Experiment vor der Ausführung.
BLI wird nun vom Oktett RED durchgeführt. Dadurch wird ein Rohdatensensogramm für die Analyse erzeugt. Die Analyse erfolgt durch das erste Öffnen der Octet Biodata Analysis Software.
Die Registerkarte Datenauswahl wird verwendet, um das Experiment zu finden und die experimentelle Zusammenfassung zu überprüfen. Die Konzentrationen des Analyten ColM werden hier eingegeben. Als Nächstes wird die Registerkarte Verarbeitung verwendet, um das Referenzsignal von den experimentellen Daten zu subtrahieren.
Die Basislinie wird definiert, um die Y-Achse so auszurichten, als ob ihre Delegierungsrate angewendet würde. Schließlich wird Prozessdaten ausgewählt. Die Daten werden für dieses Experiment isoliert, und Kurven anpassen wird ausgewählt.
Es wird eine partielle Assoziations- und Dissoziationskurvenanpassung ausgewählt. Der Kd wird aus diesem Fitting berechnet. Das Chromatogramm des Größenausschlusses wird verwendet, um die Rekonstitution des Ambute zu validieren.
Das Chromatogramm zeigt einen einzigen symmetrischen Peak, was auf eine monodisperse Proteinzubereitung hindeutet. Der Peak elutiert mehrere Milliliter nach dem Hohlraumvolumen, was auf nicht aggregierte lösliche Peptidisc-Partikel hinweist. Proteinaggregate werden im Hohlraumvolumen ausgewunden, während überschüssige Waschmittel und Peptid nach dem Hauptgipfel austreten.
Erhöhte Seuchen der gebildeten Peptidiscs, während sie noch an den Nickel-NTA-Perlen befestigt sind, sollten diesen letzten Gipfel aufbrauchen. Proteinaggregate sind oft das Ergebnis der Exposition von Speicherproteinen zu waschmittelfreien Lösungen vor der Rekonstitution. Dieses letzte Ausschlusschromatogramm ist eine nützliche Diagnose zur Fehlerbehebung bei der Rekonstitution.
Nach der Verarbeitung der experimentellen Daten ist eine Kurve an das Sensogramm anpasse. Die Genauigkeit dieses Fittings ist für die Berechnung der Dissoziationskonstante unerlässlich. Das Restansichtsdiagramm beschreibt den Unterschied zwischen den experimentellen Daten und dem Berechnungsanpassungsplan.
Dies zeigt, dass für die vier verschiedenen Spaltenkonzentrationen drei der Kurven gut passen. Bei höchster Konzentration bringt die Kurve jedoch keine gute Passform. Dies deutet darauf hin, dass bei dieser höheren Konzentration eine heterogene Bindung der Säule an den Stift besteht.
Dieses höchste Konzentrationssignal ist daher gemäß den ForteBio-Anwendungshinweisen nicht in der kinetischen Analyse enthalten. Die restlichen drei Kurven werden für die kinetische Analyse verwendet. Eine Dissoziationskonstante zwischen FhuA und ColM, die nach der BLI- und Peptidisc-Methode bestimmt wird, stimmt mit konstanten konstanten überein, die durch andere Methoden bestimmt werden.
Isotherme Kalorimetrie und Nanoscheiben sowie mikroskalige Thermoforese und Peptidisc ergaben Dissoziationskonstanten, die sich nicht wesentlich von unserem ermittelten Wert unterschieden. Diese Konsistenz validiert die Peptidisc BLI-Methode zur Messung der Interaktionskinetik. Gut, also, nachdem wir uns dieses Video angeschaut haben, hoffen wir, dass Sie ein praktisches Verständnis der Stärke und Einschränkung der PeptiQuick-Methoden gewonnen haben.
Wir haben diese Methode als besonders nützlich für die Quantifizierung der FhuA ColM-Wechselwirkung in völliger Abwesenheit von Detergenzien gefunden. Und wir vermuten, dass derselbe Workflow angewendet werden kann, um jede andere Rezeptor-Ligand-Interaktion zu charakterisieren. Viel Glück mit Ihren Experimenten.
