Diese Arbeit wurde vom NIH geförderten # DA15169 zu HEM

Vorgehensweise im Überblick: Mit diesem Ansatz sind Zelloberfläche Proteine ​​kovalent mit Biotin auf den verfügbaren extrazellulären Lysin-Reste mit einer Membran impermeante, Disulfid-gekoppelten Biotinylierungsreagenz (Sulfo-NHS-SS-Biotin) unter Menschenhandel restriktiven Bedingungen (zB bei niedriger Temperatur) bezeichnet (siehe Abb.. 1 zur Illustration). Eine Gruppe von Zellen zur Bekämpfung permissiven Bedingungen verschoben (37 ° C) und biotinylierte Proteine ​​zu verinnerlichen. Die andere Gruppe von Zellen bei niedriger Temperatur als Kontrollen für 1) die gesamte Oberfläche Protein zur Zeit = 0, und 2) stripping Kontrolle gehalten. Nach einer kurzen Periode der Internalisierung werden die Zellen wieder auf niedriger Temperatur, um die Internalisierung stoppen verschoben, und alle restlichen Oberfläche Biotin wird durch Behandlung von Zellen mit einem Reduktionsmittel, die Disulfid-gekoppelte Biotin spaltet beraubt. Biotinylierter Proteine, die von der Zelloberfläche entstanden und wurden verinnerlicht werden aus der Strippung geschützt, und die einzige biotinylierten Proteinen, die bleiben werden. Nach Zelllyse sind biotinylierten Proteinen durch Streptavidin-Affinitätschromatographie isoliert und das Protein von Interesse wird durch quantitative Immunoblot erkannt. Zur Bestimmung der endocytischen Rate, ist der Betrag, der verinnerlicht Protein auf die gesamte Oberfläche zu steuern zur Zeit = 0 gekennzeichnet verglichen. Wir haben erfolgreich dieser Ansatz verwendet, um die Internalisierung von der neuronalen Noradrenalin-1 und Dopamin-Transporter 1-4 messen. Detaillierte Protokoll: Tag 1: <ol><li> Platte Zellen in 6-Well-Platten, so dass sie ca. 80% konfluent am Tag 2 werden. Alternativ, wenn transfizierte Zellen genutzt werden, in einer solchen Dichte, dass sie ca. 80% konfluent werden zum Zeitpunkt der Internalisierung Rate gemessen werden transfizieren. Wenn Zellen nicht stark haftende, sollte Gewebekultur ware mit einer Zelladhäsion Substrat (z. B. Poly-D-Lysin) zu Zellverlust während der umfangreichen Waschschritte zu verhindern behandelt werden. </li><li> Für jedes Protein getestet, um Platte 2 Brunnen auf einer Platte, wie die gesamte Oberfläche Protein (t = 0) und Strippen Kontrollen verwendet werden. Auf einer zweiten Platte, Platte eine Vertiefung für jedes Internalisierung Zustand getestet (dh basalen endocytischen Rate vs Medikament behandelt). </li><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen und speichern bei den angegebenen Temperaturen für den Einsatz am Tag 2: <ul><li> PBS 2 +: Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM CaCl 2, (4 ° C) </li><li> Biotinylierung Quench Lösung: PBS 2 + ergänzt mit 100 mM Glycin, (4 ° C) </li><li> NT-Puffer: 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,2% BSA, 20 mM Tris, pH 8,6, (4 ° C) </li><li> RIPA Puffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,1% SDS, 1,0% Triton X 100, 1,0% Natriumdeoxycholat, (4 ° C) </li><li> Sulfo-NHS-SS-Biotin-Stammlösung: Lösen Sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) und 200 mg / ml, (-20 ° C) </li><li> Tris (2-Carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) Stammlösung: 500 mM in H 2 O, (-20 ° C, bedeckt mit Folie um Licht zu blockieren) </li></ul></li></ol> Tag 2: <ol><li> Bereiten PBS 2 + mit 0.18g/ml Glucose, 0,2% IgG / Protease-Rinderserumalbumin (PBS 2 + / g / BSA). Pre-warm diese Lösung auf 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Tauen Sie das Sulfo-NHS-SS-Biotin-Stammlösung auf der Tischplatte, um das DMSO zu schmelzen. Unmittelbar vor der Verwendung, bereiten Sie frisches Sulfo-NHS-SS-Biotin-Lösung (2,5 mg / ml in eiskaltem PBS 2 +, ausreichend für 0,75 ml / well). Vortex die Lösung kräftig auf die DMSO löslich. Beachten Sie, dass der NHS-Biotin-Reagenz leicht hydrolysiert in wässriger Lösung. Daher sollten alle Lösungen unmittelbar vor bereit, zu verwenden. </li><li> Biotinylierung: Place Platten auf einem Eisbad im Kühlraum und spülen Sie 3 x 2 ml mit eiskaltem PBS 2 +. Seien Sie sicher, dass die Platten leicht angewinkelt sind, um für die komplette Entwässerung und Entfernung der Pufferlösung zu ermöglichen. Add 0,75 ml / Vertiefung der frischen Sulfo-NHS-SS-Biotin-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren x 15 &#39;, 4 ° C auf dem Eisbad unter kräftigem Schütteln. Nach der Inkubation abgeschlossen ist, bereiten anderen frischen Sulfo-NHS-SS-Biotin-Lösung. Ersetzen Sie die alte Lösung mit der frischen Lösung, Inkubation x 15 &#39;, 4 ° C. </li><li> Abschrecken: Es ist wichtig, dass alle nicht-reagierende NHS-Biotin-Moleküle abgeschreckt werden, so dass sie nicht mit zu reagieren und Biotinylierung intrazellulären Proteinen, sobald die Zellen lysiert sind. Wash-Zellen 3 x 2 ml mit Abschrecken Lösung, Inkubation zweimal in 2 ml Quenchlösung x 15 &#39;, 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Internalisierung: Wenn die medikamentöse Behandlungen getestet werden, fügen Sie geeignete Wirkstoffkonzentration zu PBS 2 + / g / BSA. Behalten Sie die Kontrolle Platte bei 4 ° C und bringen Internalisierung Platte aus dem kalten Raum. Wash 3 x 2 ml mit vorgewärmter PBS 2 + / g / BSA (+ / - drugs) und in dieselben Lösungen (2 ml / well) zu verlassen. Füllen Sie alle leeren Brunnen mit vorgewärmten Lösung für eine gleichmäßige Temperaturverteilung über die Platte zu gewährleisten. Übertragen Sie die Zellen in ein 37 ° C Inkubator für 10 &#39;. Unmittelbar vor dem Ende von 37 ° C inkubiert, bereiten Sie frisches 50 mM TCEP-Lösung in NT-Puffer für Strippen und speichern auf Eis verwendet werden. Bereiten Sie ausreichend für 1,0 ml / well. </li><li> Stripping: Sofortüberweisung Platte (n) zu Eisbad und zum kalten Raum. Schnell waschen Sie die Zellen mit eiskaltem NT-Puffer, 3 x 2 ml bis Endozytose zu stoppen. Auch waschen Streifen Kontrollvertiefungen 3 x 2 ml mit NT-Puffer. Fügen Sie 1,0 ml frisches Stripping Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren auf Eis, 15 &#39;, 4 ° C unter leichtem Schütteln. Ersetzen Brunnen mit frischem Stripping Lösung, Inkubation weitere 15 &#39;, 4 ° C auf Eis. </li><li> Lysis: Waschen Sie alle Vertiefungen, die Strippen-Lösung, 3 x 2 ml NT-Puffer ausgesetzt waren. Dann waschen alle Vertiefungen (einschließlich der gesamten Controls) mit 3 x 2 ml PBS 2 +. Lyse in 300μl/well RIPA Puffer (oder andere Lysepuffer kompatibel für das Protein von Interesse) mit frischem Protease-Inhibitoren (1,0 mM PMSF, 1,0 pg / ml Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin). Lyse durch Schütteln x 20 &#39;, 4 ° C. Transfer zum Mikrozentrifugenröhrchen und klare Zelltrümmer durch Zentrifugation 18.000 xg, 10 &#39;, 4 ° C. </li><li> Protein Konzentrationsbestimmung: Verwenden Sie ein Protein-Assays kompatibel mit Ihrem Lyse Bedingungen (z. B. DC Protein Assay, Bio-Rad), um den Proteingehalt der Lysate zu bestimmen, wie ein Standard-BSA-Kurve verglichen. </li><li> Streptavidin-Affinitätschromatographie: Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit äquivalenten Mengen an Protein für jede Probe. Add Lysepuffer Endvolumen jeder Probe zu 200 ul zu bringen. Vortex die Streptavidin Agarose-Beads kräftig auf eine gleichmäßige Suspension zu bringen. Mit einem 200 ul Pipette mit der Spitze abgeschnitten, Pipette Perlen in jedes Röhrchen. Empfehlenswerte 20 &amp;mgr; l beads/50 pg Lysat. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C auf einem Rohr Rotator. </li></ol> Tag 3: <ol><li> Bead Waschen: Centrifuge Proben, 18.000 xg, 2 &#39;, um Perlen zu sammeln. Absaugen Lysat man aufpassen, nicht zu Wulst Pellet mit Aspirator Ansatz. Verwenden Sie einen Kunststoff-Pipettenspitze am Ende des Saugers für eine bessere Kontrolle. Add 0,75 ml Lysepuffer in jedes Röhrchen und Wirbel um Perlen zu waschen. Centrifuge Proben, 18.000 xg, 2 &#39;, um Perlen und wiederholen Anspruch erheben und zweimaligem Waschen (drei Wäschen in Summe). Nach dem letzten Waschen, saugen so viel von der Puffer wie möglich, ohne die Perlen Pellets. Tipping the tube zum Aspirator hilft bei diesem Schritt. </li><li> Beispiel Elution: In 20-25 &amp;mgr; l 2x Laemmli-Probenpuffer (reduzierend) in jedes Röhrchen. Das Reduktionsmittel wird spalten die NHS-SS-Biotin Disulfidbindung, die Freigabe der isolierten Proteine ​​in Lösung. Die meisten Membranproteine ​​sind sehr anfällig für Aggregation, wenn gekocht, und sollte nicht vor dem auf Gelen Belastung für SDS-PAGE beheizt werden. Bestimmen Sie Wärmeempfindlichkeit Ihrer Protein von Interesse vor der Durchführung dieser Experimente. Wenn Protein nicht tolerieren können kochendem / Heizung, auf einem Rotator, 30 &#39;, Raumtemperatur vor inkubieren durch SDS-PAGE Analyse. Dies ist ausreichend zur Spaltung der Disulfidbrücke und eluieren die Proteine. </li><li> SDS-PAGE und Immunoblot: Separate Proteine ​​durch SDS-PAGE. Für jede Probe ist es am einfachsten, die Proben in der folgenden Reihenfolge ausführen: Gesamtfläche (Zeit = 0), Streifen, Internalisierung Bedingung Nr. 1, Bedingung 2, etc. Transfer zum Membran für Immunoblotting und Blot mit entsprechenden Antikörper für Ihr Protein von Interesse. Erfassen immunreaktiven Banden mit einer CCD-Kamera Geldokumentationssystem, dass bestimmte, dass es keine gesättigten Pixel. Quantifizierung jedes Band Dichte mit Gel-Analyse / Densitometrie-Software. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Ein Vertreter Immunoblot Ergebnis ist in Abbildung 2a dargestellt. Das stärkste Signal ist in die &quot;totale&quot; lane (T), die Gesamtmenge an Oberflächenprotein ist vor Verinnerlichung. Der &quot;Strip&quot;-Regelung (S) sollte idealerweise in der Nähe von leer, was bedeutet, dass der Streifen effizient war für das Experiment demonstriert. Der Streifen Effizienz wird durch den Vergleich der Dichte des &quot;Strip&quot; lane, dass der &quot;total&quot; Spur berechnet werden (zB Protein, das parallel zu den Streifen biotinylierten wurde, war aber weder auf 37 ° C erwärmt, noch ausgesetzt Stripping-Lösung). Die folgende Formel verwendet: [1 - (Band / total)] * 100% Mit dieser Formel wurde der Streifen in Abbildung 2 99,8% effizienter. Schließlich werden Sie Banden geringerer Intensität als die Summe in die Internalisierung lane (s) (I) zu sehen. Im Beispiel (Abbildung 2), Zellen behandelt wurden entweder mit Fahrzeug oder 1 &amp;mgr; Phorbolmyristatacetat (PMA) während einer 10 behandelten ersten Internalisierung Zeitraum &quot;Internalisierung und Dopamin-Transporter Internalisierung Raten wurden für eine 10 &#39;gemessen. Die Internalisierung Rate wird wie folgt berechnetfolgt: verinnerlicht / insgesamt * 100 Wie in Abbildung 2B zu sehen, 10,4% der Fläche DAT über 10 &#39;unter Vehikel-behandelten Bedingungen verinnerlicht. PMA-Behandlung erhöhte DAT Internalisierung Preise auf 23,2% der Gesamtfläche DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Protokoll Illustration. Cells sind bei 4 ° C biotinylierten ausschließlich Etikett der Oberfläche der Bevölkerung und sind bis 37 ° C verschoben, um die Internalisierung zu initiieren. Nach Internalisierung Zellen werden schnell gekühlt, um endocytischen Prozesse und Restfläche Biotin Anschlag wird durch Behandlung von Zellen mit einem Reduktionsmittel befreit. Die einzige biotinylierten Proteine, die bleiben, sind jene, die von der Oberfläche bei t = 0 entstanden und wurden verinnerlicht, damit sie vor dem Abstreifen der Behandlung. Biotinylierter Proteine ​​werden durch Batch-Affinitätschromatographie mit Streptavidin-Beads isoliert und das Protein von Interesse ist durch Immunoblot nachgewiesen werden. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. PKC-Aktivierung erhöht sich die DAT endocytischen Rate. Internalisierung Assay. PC12-Zellen stabil exprimiert DAT wurden biotinylierte, 4 ° C, wie in &quot;Detaillierte Protocol&quot; beschrieben. Die Zellen wurden schnell auf 37 ° C erwärmt ± 1 nM PMA und inkubiert 10 &#39;, 37 ° C. Residual Biotin, indem ausgezogen war, wurden die Zellen lysiert und biotinylierten Proteine ​​wurden isoliert durch Streptavidin-Affinitätschromatographie. (A) Repräsentative Immunoblots zeigen Gesamtfläche DAT bei t = 0 (T), Streifen-Regelung (S), und verinnerlicht DAT (I) unter den angegebenen Bedingungen. (B) Bands wurden mit einer CCD-Kamera erfasst und quantifiziert Menge Data Software (Bio-Rad). Die Daten werden als% insgesamt DAT internalized/10 min ausgedrückt. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel Immunoblot Darstellung eines armen Biotin Streifen. Internalisierung Assay. PC12-Zellen stabil exprimiert DAT wurden biotinylierte, 4 ° C, wie in &quot;Detaillierte Protocol&quot; beschrieben. Die Zellen wurden schnell auf 37 ° C erwärmt und inkubiert 10 &#39;, 37 ° C. Residual Biotin, indem ausgezogen war, wurden die Zellen lysiert und biotinylierten Proteine ​​wurden isoliert durch Streptavidin-Affinitätschromatographie. Der Immunoblot zeigt Gesamtfläche DAT bei t = 0 (T), Streifen-Regelung (S), und verinnerlicht DAT (I). Beachten Sie die sichtbare Bande in dem Streifen Kontrolle Spur, Anzeichen für schlechte Streifen Effizienz.

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Häufige Probleme: Das häufigste Problem, dass bei diesen Versuchen ergibt sich ist schlecht Streifen Effizienz. Die Effizienz des Streifens ist von entscheidender Bedeutung in der Lage, die Ergebnisse zu interpretieren. Sofern der Streifen wurde hocheffiziente, ist es nicht möglich festzustellen, dass jeder biotinylierten Proteinen in die Internalisierung Gassen, waren in der Tat, verinnerlicht von der Oberfläche. Strips ≥ 90% Wirkungsgrad sind optimal, und wir verwerfen Ergebnisse, wenn die Streifen unter ...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Plasma-Membran-Proteine ​​sind eine große, heterogene Gruppe von Proteinen, Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter und Pumpen umfasst. Die Aktivität dieser Proteine ​​ist verantwortlich für eine Vielzahl von Schlüsselbegriffen zellulären Ereignissen, einschließlich Nährstoffzufuhr, zelluläre Erregbarkeit und chemische Signalisierung. Viele Plasmamembranproteinen werden dynamisch von endocytischen Menschenhandel, die Funktion von Proteinen moduliert durch die Veränderung Proteinoberfläche Ausdruck geregelt. Die Mechanismen, die Protein Endocytose zu erleichtern, sind komplex und nicht vollständig für viele Membranproteine ​​verstanden. Um das Verständnis der Mechanismen, die die endocytischen Handel mit einem bestimmten Protein-Steuerung, ist es entscheidend, dass das Protein s endocytischen Rate präzise gemessen werden. Für viele Rezeptoren, sind direkte endocytischen Rate-Messungen häufig erreicht Verwendung markierter Rezeptor-Liganden. Doch für viele Klassen von Membranproteinen, wie etwa Transporter, Pumpen und Ionenkanäle, gibt es keine passende Ligand, mit dem die endocytischen Rate gemessen werden kann. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine reversible Biotinylierung Methode, die wir einsetzen, um die Dopamin-Transporter (DAT) endocytischen zu messen. Diese Methode stellt eine einfache Methode zur Messung von Internalisierung Raten und kann leicht für den Handel mit Studien der meisten Membranproteine ​​eingesetzt werden.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Serie: Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...