Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methodik für die Vorbereitung und Handhabung von Muskelgewebe in präklinischen Umgebungen und klinischen Studien, was wichtig ist, um zuverlässige Ergebnisse im DMD-Bereich zu erhalten. Die Techniken sind relevant für exon überspringen Tryouts für DMD. Und der Hauptvorteil ist, dass sie gut etabliert und reproduzierbar sind, wenn sie kollektiv durchgeführt werden.
Diese Techniken konzentrieren sich hauptsächlich auf Exon-Skipping in DMD, aber mit einem Wechsel der Primer können die gleichen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die mit Spleißtherapien behandelt werden. Diese Methoden können verwendet werden, um Exon-Skipping-Effizienz sowohl als auch RNA und Protein zu erreichen. Um eine Probe für die Analyse vorzubereiten, mischen Sie zuerst gleiche Mengen an Tragacanth-Kaugummi und Wasser, bis das Zahnfleisch weich und klebrig wird.
Diese Mischung in 25-Milliliter-Spritzen geben und 0,5 bis 1 Zentimeter Kaugummi auf einzelne Korkscheiben abgeben. Beschriften Sie die Scheiben auf der gegenüberliegenden Seite und legen Sie einen Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff, bis ein Teil der Flüssigkeit gefriert. Legen Sie jede Probe in das Tragacanth-Kaugummi auf den Scheiben mit einer Längsachse jedes Muskels senkrecht zum Kork.
Legen Sie Kaugummi an den Boden jedes Muskels, um den Muskel an Ort und Stelle zu halten, und verwenden Sie pinnzere, um die Proben in der kälte isopentane einzufrieren. Bewegen Sie die Proben kontinuierlich für eine Minute oder bis vollständig gefroren, bevor Sie sie vorübergehend auf Trockeneis legen. Dann legen Sie die Proben in Glasfläschchen für 80 Grad Celsius Lagerung.
Um das gefrorene Muskelgewebe für die Analyse zu sektionieren, stellen Sie einen Kryostat auf eine Arbeitstemperatur von 25 Grad Celsius ein und montieren Sie den Muskelblock auf den Halter. Schneiden Sie den Gewebeblock, bis flache Abschnitte erreicht sind. Für Reverse-Transkriptase-PCR- und Western-Blot-Analysen erhalten Sie 10 Mikrometer dicke Scheiben.
Für die immunhistochemische Analyse erhalten sie sechs bis acht Mikrometer dicke Scheiben und für Hämatoxylin- und Eosinfärbung 10 bis 12 Mikrometer dicke Scheiben. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte nach derEn Erwerb in zwei Milliliter-Rohre. Bewahren Sie die Proben für PCR und Western Blotting bei 80 Grad Celsius auf.
Hier werden Mikrochip-Elektrophorese-System, ein Gel-Bild von Reverse-Transkriptase-PCR-Reaktionen und die Sequenzierungsergebnisse des übersprungenen Bandes von zwei Patienten vor und nach der Behandlung mit einem Antisense-Oligonukleotid in einer Dosiseskalationsphase 1-Studie gezeigt. Beide Patienten hegen Streichungen. Wie erwartet zeigten beide Patienten vor der Behandlung kein Überspringen und nur ein nicht übersprungenes Band konnte visualisiert werden.
Nach 12 Wochen Der Behandlung wurde für den zweiten Patienten ein deutlich übersprungenes unteres Band visualisiert, es war jedoch immer noch schwierig, ein übersprungenes Produkt für den ersten Patienten zu erkennen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten eine Verkettung der Exons 47 und 54 für den zweiten Patienten und exons, 44 und 54 für den ersten Patienten. Um den übersprungenen Prozentsatz zu berechnen, wurde die Molkonzentration für das übersprungene Band durch die übersprungenen und nicht übersprungenen Bänder geteilt.
Wie erwartet, wurde kein Dystrophinband von Western Blot vor der Behandlung nachgewiesen. Nach der Behandlung wurde beim zweiten Patienten ein Band mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Vergleich zu dem bei der gesunden Kontrolle beobachteten Band nachgewiesen. Der erste Patient zeigte jedoch nach der Behandlung keine nachweisbaren Dystrophinspiegel.
Es ist wichtig, das Muskelgewebe richtig zu behandeln und jede Probe auf dem Tragacanth-Zahnfleisch in konsistenter Weise zu platzieren. Die Gewebeabschnitte können auf verschiedene Arten analysiert werden, einschließlich künstlicher PCR, digitaler PCR, Western Blot, Immunhistochemie und mit verschiedenen Arten von Omics. Diese Techniken können beschleunigt werden, die Entwicklung, zusätzliche Exon überspringen Medikamente auf verschiedene Exons, und kann auf die Entwicklung von viralen basierten und wieder in der Bearbeitung für DMD angewendet werden.
