Dieses Protokoll beschreibt einen zellulären Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz unter Verwendung eines anpassungsfähigen Management-Reporters. Dieser Reporter-Assay kann verwendet werden, um die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Mutationen in den Exxon- oder Spleißstellen zu untersuchen und eine Therapie, insbesondere ein Partikel, zu entwickeln, um die Erkennung von mutierten bis fünf Punkt-Spleißstellen zu verbessern. Die Passage in Hela-Zellen saugt das verbrauchte Medium ab und inkubiert die Zellen mit drei Millilitern von 0,2 5% Auslösungen in einem Millimolaren EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.
Nach der Inkubation an sieben Milliliter frischem DMEM wird die Zellsuspension in ein 10-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem DMEM und platten Sie die Zellen auf einer neuen Gewebekulturschale bei 20% Konfluenz für vorübergehende Transsfektionen.
Zählen Sie die Hela-Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Objektträger und bereiten Sie eine Suspension mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis zur fünften Zelle pro Milliliter vor, säen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag saugen Sie das verbrauchte Medium ab und geben Sie 800 Mikroliter frisches DMEM mit Serum auf die Platte. Bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor und wirbeln Sie sie für 15 Sekunden.
Dann zentrifugieren Sie die Mischungen und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Inkubation alle 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in eine Vertiefung der 12 Well Hela Zellplatte geben, um ein Endvolumen von einem Milliliter pro Vertiefung zu erreichen, und die Platte bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren. Die vorbereiteten Markierungsreaktionen sind inkubierend.
Resuspend die 25 Kilo Dalton Molekulargewicht Cutoff Size Ausschlussperlen durch sanftes Wirbeln für 10 Sekunden. Als nächstes werden 600 Mikroliter der resuspendierten Perlen in eine Einweg-Minisäule gegeben, in ein 1,5-Milliliter-Auffangrohr gelegt und der Perlenbestand auf vier Grad Celsius zurückgeführt. Zentrifugieren Sie die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss durch sie hindurch.
Dann waschen Sie die Perlen zweimal, indem Sie 300 Mikroliter RNA-freies Wasser in die Säule geben. Nach der zweiten Wäsche die Minisäule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und die Kinase-Reaktionsmischung in die Säule geben. Zentrifugieren Sie die Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die P32-markierten Oligonukleotide enthält.
Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den Helizellen extrahiert wurde, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 6,55 Mikroliter zu erhöhen. Als nächstes fügen Sie 0,9 Mikroliter hinzu, einen Master-Mix zu jedem PCR-Röhrchen, das die RNA-Proben enthält, und inkubieren Sie die Röhrchen zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und dann eine Minute auf Eis. Als nächstes bei 2,55 Mikrolitern, einem Master-Mix zwei, zu jedem Röhrchen, das die RNA enthält, und Master-Mix eins, und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einen Thermocycler gegeben und zuerst bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und dann bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden jeder Probe 10 Mikroliter 2X Formamid-RNA-Beladungsfarbstoff hinzugefügt und die Fragmente nach UIA-Seite getrennt. Percy DNA-Synthese.
Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den transezierten Hela-Zellen extrahiert wurden, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNAs freies Wasser hinzu, um das Volumen auf niedrige 11 Mikroliter aufzufüllen. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter hinzu, mischen Sie einen zu jeder Probe und inkubieren Sie zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten, dann auf Eis für eine Minute. Als nächstes fügen Sie sieben Mikroliter hinzu, mischen Sie zwei zu jeder Tube und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und 70 Grad Celsius für 15 Minuten.
Als nächstes verdünnen Sie für die PCR die C-DNA-Reaktion, um eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten, und übertragen Sie einen Mikroliter jeder CDNA-Probe auf neue PCR-Röhrchen. Fügen Sie 10,5 Mikroliter der Mastermischung zu jedem Röhrchen hinzu, das CDNA enthält, und führen Sie die PCR durch. Verwendung eines Thermocyclers Nach Abschluss der PCR.
Fügen Sie jedem Röhrchen 12,5 Mikroliter 2X Formamid-DNA-Beladungsfarbstoff hinzu. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius und führen Sie eine UIA-Seite durch. Pipettieren Sie fünf Mikroliter verdünnter CDNA in einzelne Vertiefungen einer 96-Well qpcr-Platte dreifach.
Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Echtzeit-PCR-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, versiegeln Sie die Platten mit einem optischen Film und zentrifugieren Sie, um die Reaktionen am Boden der Wells zu sammeln, und führen Sie dann die qpcr durch, während Sie die Schwellenwert-Quantifizierungszykluswerte des Zielamplikons sammeln. Bevor Sie die Marker und Proben laden, spülen Sie die Bohrlöcher mit FSME-Puffer aus, um den abgesetzten Harnstoff zu entfernen. Laden Sie dann 10 Mikroliter jeder Probe pro Vertiefung und lassen Sie das Gel zwei bis drei Stunden lang mit 300 bis 500 Volt laufen, oder bis das Xylol den Boden erreicht.
Nach der Elektrophorese die Glasplatten aus dem Elektrophoreseapparat entfernen und die beiden Platten vorsichtig trennen, so dass das Gel flach auf beiden Glasoberflächen liegt, dann das Gel auf ein Filterpapier übertragen und mit einer Plastikfolie abdecken, wobei das Gel mit einem Geltrockner 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius vakuumgetrocknet wird. Legen Sie dann das getrocknete Gel in eine Phosphor-Bildgebungskassette für die Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn er in Hela-Zellen exprimiert wird, drückt der Schneidereporter dup 51 minnijean das reife Transkript in voller Länge aus, in dem Exxon two effizient gespleißt wird. Die fünf Prime-Spleißstellenmutationen und dup 51 P reduzieren die Exxon-Zwei-Einschließung von 95 auf 30%, was zur Bildung eines kürzeren Transkripts führt.
Die Co-Expression von dup 51 P mit U15A SNRNA rettet Exxon zwei Spleißungen und stellt die Bildung des Transkripts in voller Länge wieder her. Im Gegensatz dazu hat die Co-Expression mit wilden U1- oder U15G-Varianten nicht den gleichen Effekt auf das dup 51P-Spleißen. Der Nachweis von U15A-Variantentranskripten verwendet primär das U1-Sieben- bis 26-Oligon-Nukleotid, das 20 Nukleotide lang ist, und Basenpaare in der Nähe des Adenins an der fünften Position der U1-SNRNA.
In Gegenwart von DATP allein ermöglicht U1 sieben bis 26 die Integration von zwei bis drei Nukleotiden für die endogene Wildtyp-U1-SNRNA, was zu einem 22 oder 23 Nukleotid langen Produkt führt. Für U15A- und U15G-Varianten endet die Erweiterung nach Zugabe eines einzelnen Adenosins, das ein 21-Nukleotidprodukt erzeugt. Nach Der Normalisierung auf U2-SNRNA-Expression wurden transfizierte U1-Wildtyp-Varianten U1 5g und U15A drei- bis fünffach über der endogenen SNRNA exprimiert.
Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse. Daher wird die Verwendung von RNA-freiem Wasser und die Dekontamination von Diensten mit RNAs-Inaktivierungsmitteln dringend empfohlen. Das hier beschriebene Berichtssystem kann angewendet werden, um die Rolle von U1 SN-RNAs bei Spleißvorschriften für die Umkehrung der Wirkung von Flash-Preis-Spleißmutationen für das Gen-Silencing unter Verwendung modifizierter U1SN-RNAs zu untersuchen.
