Die in diesem Protokoll beschriebene Tracing-Technik hilft uns, neuronale Morphogenese zu studieren und die Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila zu schnappen. Der lipophile Farbstoff kann schnell auf jeden Teil der Zellmembran mit einer extrem hohen Dichte diffundieren. Aus diesem Grund löst unser Protokoll effizient, Strukturen eines markierten Neurons zu finden.
Wenn ein Axonterminal mit einer Injektionsmikropipette zugänglich ist, könnte diese Technik auf jedes Neuron in den Larven- und Erwachsenenstadien von Fliegen oder in anderen Organismen angewendet werden. Wenn Sie keine Erfahrung mit der Sezieren oder Verwendung eines Mikroinjektors haben, der die Operation an der Probe präzise, kann dies eine Herausforderung darstellen. Das Verständnis der Anatomie des Embryos, wird mit Anleitung zu richtigen Portionierung von Werkzeugen helfen, um Sezieren oder eine Dinjektion durchzuführen.
Um zu beginnen, vorzubereiten und Layout alle Embryo-Sammlung Materialien. Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50-Milliliter-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen. Legen Sie dann einen Netzfilter mit 100 Mikrometer Poren zwischen rohr und kappe n.A. fest.
Bereiten Sie die Farbstoffinjektionsmikropipette und Diesektionsnadel aus demselben Kapillarschlauch mit einem Innendurchmesser von 1,2 Millimetern vor. Ziehen Sie die Schläuche mit einer Mikropipette, Ziehen bei 7% von 170 Volt maximale Leistung, um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von etwa 0,4 Zentimeter n Länge zu schaffen. Um die Farbstoffinjektionsmikropipette vorzubereiten, den Schleifer mit einem Benetzungsmittel einweichen und die Nadel auf die Mikropipetteklemme bei 25 bis 30 Grad legen.
Senken Sie dann die Spitze auf zwei Drittel des Radius aus der Mitte der Abschrägungsfläche heraus. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schläuchen Luft hineinschiebt. Markieren Sie die Mikropipette mit einem feinspitzen permanenten Marker, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig sein kann, die schmale Öffnung zu lokalisieren, die in einem Winkel gebildet wird.
Lassen Sie die Fliegen Eier über Nacht bei Raumtemperatur legen und sammeln Sie die Pfeife mit den Eiern am Morgen. Um die Embryonen zu sammeln, entchloren Sie die Eier auf dem Teller mit 50% Bleichmittel für fünf Minuten. Sobald die Chlorionen geklärt sind, gießen Sie den Inhalt der Platte durch das Filtrationsgerät oder Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren.
Verwenden Sie eine Squeeze-Flasche Wasser, um die Bleichmittel auf dem Teller zu verdünnen und so viele Embryonen wie möglich zu sammeln, indem Sie die Mischung in den Filter dekantieren. Waschen Sie die Embryonen drei- bis viermal mit Wasser, bis sich der Bleichgeruch auflöst. Entfernen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie ihn auf eine andere saubere Platte mit Wasser.
Dann dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden. Verwenden Sie feine Zangen, um fünf bis zehn Embryonen bei 15 Stunden nach der Eiablage auszuwählen und legen Sie sie auf doppelseitiges Klebeband mit der dorsalen Seite nach oben. Fügen Sie Insektenringer-Salzin in den Sezierpool, um die Embryonen vor Austrocknung zu schützen.
Verwenden Sie eine Glasnadel unter einem Seziermikroskop, um den Embryo aus der Middling-Membran aus dem Band auf das Glas zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass das innere Gewebe des Embryos nicht beschädigt wird. Dann durchschneiden Sie die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren zum vorderen Ende. Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte und befestigen Sie die epidermale Kante an der Oberfläche des Glasschlittens.
Verwenden Sie eine Rohr-verbundene Nadel mit einer Spitzenöffnung von etwa 300 Mikrometern, um Luft zu aspirieren oder zu blasen, um die dorsalen Längs-Trachealstämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu entfernen. Verwenden Sie 4%PFA und PBS, um die Embryonen für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker zu fixieren. Dann waschen Sie sie dreimal mit PBS.
Färben Sie die Embryonen mit einem Mikroliter Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper, der mit Cyanine3-Farbstoff konjugiert ist, und 200 Mikroliter PBS für eine Stunde auf dem Orbitalshaker. Und wiederholen Sie die Wähungen in PBS. Um die Injektionsmikropipette zu füllen, legen Sie sie in den Kapillarhalter.
Als nächstes legen Sie den Farbstoff auf die Bühne und verwenden Sie den Mikromanipulator, um ihn über dem Schlitten zu positionieren. Passen Sie dann die Bühne an, um die Mikropipette auf den Farbstoff zu legen. Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den Injektionsdruck auf 200 bis 500 Hektopascal, die Injektionszeit zwischen 0,1 und 0,5 Sekunden und den Kompensationsdruck auf Null für fünf Minuten einstellen.
Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbstoffschlitten und legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Erhöhen Sie dann den Kompensationsdruck auf einen Bereich von 30 bis 60 Hektopascal und senken Sie die Mikropipette in die Probe. Verwenden Sie die 10-fache Objektivlinse, um den Embryo zu lokalisieren und die Mikropipette mit dem Embryo auszurichten.
Ändern Sie die Objektivlinse in eine 40-fache Linse. Und tauchen Sie die Linse in die PBS. Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die neuronale Morphologie zu überprüfen, die durch Anti-HRP Cy3 gekennzeichnet ist, und bestimmen Sie die Injektionsstelle.
Wenn der Embryo im Fokus ist, ändern Sie die Position der Mikropipette, um sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse zu machen. Verwenden Sie dann die Hellfeldmikroskopie während der Injektion, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Lassen Sie den Farbstoff im rechten Bauchhemisegment an der neuromuskulären Kreuzung von aCC oder RP3 entweder mit DiD oder DiO fallen.
Verwenden Sie die Handsteuerung, um den Farbstoff loszulassen und die Mikropipette zu entfernen. Fahren Sie dann zur nächsten Injektionsstelle. Inkubieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker vor der Bildgebung.
Entfernen Sie die Bänder mit feinen Zangen von der Glasrutsche. Um die Probe zu montieren, bereiten Sie einen Abdeckschlupf mit einer kleinen Menge Vakuumfett an den vier Ecken vor. Legen Sie es vorsichtig auf die Probe, um sicherzustellen, dass Luftblasen zu vermeiden.
Drücken Sie den Deckelbeleg nach unten, um den Abstand von der Probe anzupassen, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und dem Dia zu ermöglichen. Entfernen Sie überschüssige PBS mit Aufgabentüchern. Die Ränder des Deckelschlupfs vollständig mit Nagellack versiegeln.
Bild bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop und verarbeiten die Bilder mit der imageJ-Software. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das aCC Motorneuron innervating Muskel eins und die RP3 Motor Neuron innervating Muskeln sechs und sieben retrograd. Dendritische Zweige aus den Motorneuronen ACC und RP3 weisen eine große Überlappung auf.
Beide Neuronen sind bipolar und stellen zwei verschiedene Populationen von Dendriten her. Um die quantitativen Fähigkeiten dieser Methode zu demonstrieren, wurde die Gesamtzahl der Dendritenspitzen in Wildtyp- und Dscam1-Mutanten gezählt. Die ipsilateralen Dendriten von aCC werden für den wilden Typ gezeigt, aber nur wenige ipsilaterale Dendriten wurden für die Dscam1 Mutant beobachtet.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Größe des Farbstofftröpfchens entscheidend ist, die etwa 10 bis 20 Mikrometer beträgt. Testen Sie die Größe auf dem doppelseitigen Band, und wenden Sie sie dann auf die Injektionsstelle an. Mit diesem Verfahren können wir die fotoschaltbare Eigenschaft der DiD-Sonde nutzen, um hochauflösende Bilder der Plasmamembran zu erhalten.
Auf diese Weise können wir die ultrastrukturelle Charakterisierung der synaptischen Membranen an der neuromuskulären Kreuzung untersuchen. Wir haben den Klick gemacht. Wir führten eine phänotypische Analyse der aCC Dendriten in mutierter Sorte durch und entdecken, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Injektion die Stelle des Dendritenauswachsens in aCC definiert.
