A técnica de rastreamento descrita neste protocolo nos ajuda a estudar a morfogênese neuronal e a quebrar a conectividade no sistema de neurônios motores de Drosophila. O corante lipofílico pode difundir rapidamente cada parte da membrana celular com uma densidade extremamente alta. É por isso que nosso protocolo resolve eficientemente encontrar estruturas de um neurônio rotulado.
Se um terminal de axônio estiver acessível com uma micropipette de injeção, essa técnica pode ser aplicada a qualquer neurônio nos estágios larval e adulto de moscas ou em outros organismos. Se você não tem experiência em dissecar ou usar um microinjetor precisa da operação no espécime, pode ser desafiador. Entender a anatomia do embrião, ajudará com orientação para a porção adequada de ferramentas para realizar dissecção ou uma dinjeição.
Para iniciar, prepare e desemem tudo sobre materiais de coleta de embriões. Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mililitros e cortando um orifício na tampa. Em seguida, coloque um filtro de malha com 100 poros de micrômetro entre o tubo e a tampa.
Prepare a micropipette de injeção de corante e a agulha de dissecção a partir da mesma tubulação capilar com diâmetro interno de 1,2 milímetros. Puxe a tubulação com uma micropipette, puxe a 7% da saída máxima de 170 volts para criar uma agulha afiada com um afunilamento de cerca de 0,4 centímetros de comprimento. Para preparar a micropipette de injeção de corante, mergulhe o moedor com um agente de molhar e coloque a agulha no grampo de micropipette a 25 a 30 graus.
Em seguida, abaixe a ponta em dois terços do raio para fora do centro da superfície de chanfrado. Triture a agulha enquanto uma seringa com tubo empurra ar para dentro. Marque a micropipette com um marcador permanente de ponta fina para indicar a posição da abertura na ponta após o chanfrado, pois pode ser desafiador localizar a abertura estreita que é formada em um ângulo.
Deixe as moscas colocarem ovos durante a noite em temperatura ambiente e coletar o tubo com os ovos pela manhã. Para coletar os embriões, descrilorizar os ovos na placa com 50% de alvejante por cinco minutos. Uma vez que os cloros tenham limpado, despeje o conteúdo da placa através do aparelho de filtragem ou coador celular para isolar os embriões.
Use uma garrafa de água para diluir o alvejante deixado na placa e reúna o maior número possível de embriões decantando a mistura no filtro. Lave os embriões três a quatro vezes com água até que o odor alvejante se dissipe. Retire o filtro do aparelho e lave-os em outra placa limpa com água.
Em seguida, decantar a água da nova placa em que os embriões estão. Use fórceps finos para selecionar de cinco a 10 embriões às 15 horas após a colocação do ovo e coloque-os em fita dupla face com o lado dorsal voltado para cima. Adicione soro fisiológico de insetos à piscina de dissecção para proteger os embriões da proficação.
Use uma agulha de vidro sob um microscópio de dissecção para arrastar o embrião da membrana middling da fita para o vidro, tomando cuidado para não danificar os tecidos internos do embrião. Em seguida, corte através da linha média de um único embrião em sua superfície de sua extremidade posterior para anterior. Vire os tecidos epiteliais do centro e conecte a borda epidérmica na superfície do deslizamento de vidro.
Use uma agulha conectada com uma abertura de ponta de cerca de 300 micrômetros para aspirar ou soprar ar para remover os troncos traqueais longitudinais dorsais, bem como quaisquer tripas restantes. Use 4% PFA e PBS para fixar os embriões por cinco minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital. Em seguida, lave-os três vezes com PBS.
Manche os embriões com um microlitro de anticorpo peroxidase anti rabanete conjugado com corante de cianeina3 e 200 microliters de PBS por uma hora no agitador orbital. E repita as lavagens na PBS. Para preencher a micropipette de injeção, coloque-a no suporte capilar.
Em seguida, coloque o slide de corante sobre o palco e use o micromanipulador para posicioná-lo sobre o slide. Em seguida, ajuste o palco para colocar a micropipette no corante. Colete o corante na micropipette definindo a pressão de injeção entre 200 e 500 hectopascal, o tempo de injeção entre 0,1 e 0,5 segundos e a pressão de compensação a zero por cinco minutos.
Uma vez coletado o corante, remova o slide de corante e coloque a amostra no estágio do microscópio. Em seguida, aumente a pressão de compensação para uma faixa de 30 a 60 hectopascal e abaixe a micropipette na amostra. Use a lente 10 vezes objetiva para localizar o embrião e alinhar a micropipette com o embrião.
Mude a lente objetiva para uma lente de imersão em água 40 vezes. E submergir a lente na PBS. Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção.
Quando o embrião está em foco mude a posição da micropipette para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse. Em seguida, use microscopia de campo brilhante durante a injeção para ver a gota de corante. Solte o corante no hemisegmento abdominal direito na junção neuromuscular de aCC ou RP3 com DiD ou DiO.
Use o controle manual para liberar o corante e remova a micropipette. Em seguida, passar para o próximo local de injeção. Incubar a amostra por uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital antes da imagem.
Usando fórceps finos, remova as fitas do deslizamento de vidro. Para montar a amostra, prepare um deslizamento de cobertura com uma pequena quantidade de graxa de vácuo nos quatro cantos. Coloque-o cuidadosamente na amostra, certificando-se de evitar bolhas de ar.
Empurre para baixo o deslizamento de cobertura para ajustar o espaço da amostra para permitir a distância de trabalho entre a lente objetiva e o slide. Remova qualquer excesso de PBS com lenços de tarefa. Sele completamente as bordas do deslizamento da tampa com esmalte.
Imagem em 10 vezes e 100 vezes ampliação com um microscópio confocal e processe as imagens, com o software imageJ. Este protocolo foi usado para rotular retrógrado o neurônio motor aCC inervando o músculo um e o neurônio motor RP3 inervando os músculos seis e sete. Os ramos dendráticos dos neurônios motores ACC e RP3 mostram extensa sobreposição.
Ambos os neurônios são bipolares, estabelecendo duas populações diferentes de dendritos. Para demonstrar as capacidades quantitativas deste método, o número total de pontas dendrite foi contado em tipo selvagem e mutantes Dscam1. Os dendritos ipsilaterais de aCC são mostrados para o tipo selvagem, mas poucos dendritos ipsilaterais foram observados para o mutante Dscam1.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tamanho da gotícula de corante é crucial, que é de aproximadamente 10 a 20 micrômetros. Teste o tamanho da fita dupla face e, em seguida, aplique-a no local da injeção. Usando este procedimento, podemos aproveitar a propriedade comutação fotográfica da sonda DiD para obter imagens de super resolução da membrana plasmática.
Dessa forma, podemos estudar a caracterização ultra estrutural das membranas sinápticas na junção neuromuscular. Fizemos o clique. Realizamos análise fenotípica dos dendritos aCC na cepa mutante, e descobrimos que uma injeção Dscam1-Dock-Pak define o local do crescimento do dendrito no ACC.
