Diese Methode kann leicht für die Beobachtung von Signalen von anderen fluoreszierenden Proteinen angepasst werden oder kann verwendet werden, um Axone bei anderen Erwachsenen abzubilden Der Hauptvorteil dieser Technik ermöglicht eine hervorragende dreidimensionale Rekonstruktion und Visualisierung der Axone und ihrer Terminallaube. Beginnen Sie mit dem Befüllen der entsprechenden Anzahl von Brunnen in einer Glas-Multi-Well-Platte mit 70% Ethanol. Verwenden Sie einen Pinsel, um 15 bis 20 Kohlendioxid-anästhetisierte Fliegen jeden Alters oder Geschlechts zu jedem Brunnen hinzuzufügen und die Fliegen vorsichtig in das Ethanol zu tappen, bis sie vollständig untergetaucht sind.
Nach nicht mehr als einer Minute die Fliegen dreimal mit 0,3% nichtionischer Tensid-Waschmittellösung in phosphatgepufferter Saline für mindestens 10 Minuten pro Wäsche abspülen. Nach der letzten Wäsche, verwenden Sie Zange, um den Kopf und Bauch jeder Fliege zu entfernen, ohne das Brustsegment oder die Beine zu beschädigen und verwenden Sie die Spitze eines Paares von feinen Zangen, um sanft, aber fest Druck auf die Coxa-Thorax-Kreuzung auszuüben, um ein Bein vom Brustsegment zu lösen. Legen Sie die Beine in einen Brunnen einer neuen Multi-Well-Platte mit frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd auf Eis für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius.
Es ist wichtig, die Beine sanft in den Fixationspuffer zu schieben, ohne sie schweben zu lassen, um gut fixierte Beine zu erhalten. Am nächsten Tag die Beine fünfmal in frischer 0,3% nicht-ionischer Tensid-Waschmittellösung für 20 Minuten pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche das Reinigungsmittel durch ein Montagemedium ersetzen und die Beine mindestens 24 Stunden im Montagemedium halten.
Am nächsten Tag ca. 20 Mikroliter 70% Glycerin neben das beschichtete Ende des Glasmikroskopschlittens geben und das Glycerin mit einem 22 mal 22 Millimeter großen Deckelbedecken bedecken. Als nächstes fügen Sie ca. 10 Mikroliter Linie des Montagemediums auf der rechten Seite des Coverslip und wenden Sie eine zweite 30 Mikroliter Linie von Montagemedium auf der rechten Seite der 10-Mikroliter-Linie. Mit feinen Zangen ein Bein von der Multi-Well-Platte in einem Tropfen Medium auf den 10-Mikroliter-Streifen des Montagemediums in einer äußeren Seitenausrichtung nach oben oder unten übertragen.
Wiederholen Sie dies, bis sechs bis acht Beine montiert und ausgerichtet sind, und legen Sie einen zweiten Coverslip über die Beine, so dass der zweite Coverslip leicht auf dem ersten Coverslip ruht. Dann nagellackieren an jeder Ecke der Abdeckungenlips, um sie an Ort und Stelle zu sichern. Um die Beine abzubilden, verwenden Sie den 488-Nanometer-Laser und zwei Detektoren gleichzeitig, um die erste Spur für die Erlangung sowohl der GFP- als auch der Cuticle-Autofluoreszenz einzurichten.
Wählen Sie ein 20- bis 25-faches Öl-Eintauchziel aus und legen Sie die Auflösung auf 1024 x 1024 Pixel mit einer 12-Bit-Tiefe fest, und legen Sie den Z-Abstand auf ein Mikrometer fest. Laden Sie den Schlitten auf die Mikroskopstufe und verwenden Sie die gleiche Laserleistung für beide Detektoren, passen Sie die Verstärkung des ersten Detektors an, um ein helles GFP-Signal zu erhalten, und passen Sie den zweiten Detektor an, um sicherzustellen, dass einige Bereiche mit einem hohen Cuticle-Signal ein gesättigtes Signal in diesem Detektor erzeugen. Zeigen Sie dann die Beine mit den Kachel- oder Positionsoptionen, um das gesamte Bein zu erfassen, wenn ein Bein verlängert oder zu groß ist, um in einem einzigen Rahmen abgebildet zu werden.
Für die Bildverarbeitung öffnen Sie den konfokalen Stapel in ImageJ Fiji und verwenden Sie das Bio-Formats-Plugin, um alle Bilder zu öffnen, die nicht im TIFF-Format vorliegen. Um die Kanäle aufzuteilen, wählen Sie Bild, Farbe und Geteilte Kanäle aus. Um das Nagelsignal vom GFP-Signal zu subtrahieren, öffnen Sie den Prozess- und Bildrechner und wählen Sie den Stapel aus Detektor eins als Bild eins aus.
Wählen Sie im Betriebsfenster subtrahieren und wählen Sie die Spur aus Detektor zwei als Bild zwei aus, so dass nur das endogene GFP-Signal erhalten wird. Verwenden Sie Image, Stacks, Z Protect, um maximale Intensitätsprojektion für das endogene GFP-Signal zu generieren. Verwenden Sie die Steuerelemente im Helligkeitskontrollfenster, um die Helligkeit und den Kontrast anzupassen.
Generieren Sie dann eine durchschnittliche Intensität für die Nagelhaut, gefolgt von Bild-, Farb- und Mergekanälen, um den GFP-Stack wieder mit dem nur von Detektor zwei erworbenen Cuticle-Stack zu verschmelzen. Dies führt zu einem RGB-Bild, das aus dem gewebespezifischen GFP-Signal sowie dem Nagelhautsignal besteht, um die Axon-Arbors innerhalb der Beinsegmente zu identifizieren. Um das Makro zu verwenden, öffnen Sie den konfokalen Stapel, und klicken Sie auf Bild, Anpassen und Helligkeit/Kontrast.
Klicken Sie dann auf Plugin und Makroausführen, um das Makro auszuführen und den Anweisungen zu folgen. Wenn Sie aufgefordert werden, den Vorgang im Bildrechnerfenster anzugeben, wählen Sie Bild eins als Stapel eins aus. Wählen Sie im Vorgangsfenster Subtrahieren aus.
Wählen Sie Bild zwei als Stapel zwei aus. Wenn Sie aufgefordert werden, den Kontrast anzupassen, verwenden Sie die Steuerelemente im Helligkeitskontrollfenster, um den Helligkeitskontrast des maximalen Projektionsbildes von GFP und der durchschnittlichen Projektion der Nagelhaut anzupassen, um ein RGB-zusammengeführtes Bild beider Signale zu erzeugen, das das GFP in Grün und die Nagelhaut in Grau anzeigt. Führen Sie dann die Ergebnisse von Stapel eins und Stapel zwei zusammen, um einen kombinierten GFP- und Cuticle-Stack zu generieren, der in der nächsten Phase verwendet werden kann.
Um die Beine in drei Dimensionen zu visualisieren, öffnen Sie den RGB-Stack in einem geeigneten 3D-Softwareprogramm. Wählen Sie im Popup-Dialogfenster alle Kanäle im Moduskonvertierungsabschnitt aus und geben Sie die Größe eines Voxels ein, der aus der vorherigen Analyse erhalten wurde. Klicken Sie im Kanal-Modul mit der rechten Maustaste und wählen Sie Display und Volren aus.
Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf das Volren-Modul. Klicken Sie im Abschnitt Eigenschaften mit der linken Maustaste auf Erweitert, und wählen Sie DDR aus. Passen Sie dann den Gammawert an, um den Nagelhintergrund anzuzeigen.
Klicken Sie im Modul Kanal 2 mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Volren anzeigen aus. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf das Volren-Modul, Bearbeiten und wählen Sie volrenGreen.col aus. Mit diesem Verfahren kann das Signal aus der Nagelhaut mit dem GFP-Signal kombiniert werden, um die Positionierung der Axone in den Beinen zu identifizieren.
Es ist von entscheidender Bedeutung, gut fixierte Beine zu erhalten. In richtig fixierten Beinen sind die inneren Strukturen in den Beinen einheitlich und die dunkel sind sichtbar. In schlecht fixierten Beinen ist dunkles Material im Tarsus und Tibia vorhanden und das Trachealsystem ist im Oberschenkelknochen und coxa nicht deutlich sichtbar.
Das verfahren, das wir hier beschrieben haben, überwindet die Herausforderung, fluoreszierende Expression in motorischen Neuronaxonen durch eine dicke und autofluoreszierende Nagelhaut mit hoher Auflösung zu erkennen. Das erhaltene saubere und detaillierte Fluoreszenzsignal ermöglicht es uns, das dreidimensionale Merkmal der Axon-Arbors mit 3D-Bildgebungsprogrammen zu visualisieren und zu quantitieren. Diese Technik wird es uns ermöglichen, erwachsene Drosophila als Modell zu verwenden, um nicht nur die Entwicklung von motorischem Neuron zu studieren, sondern auch zu studieren, um die Auswirkungen degenerativer Erkrankungen wie ERAS auf das integrierte Bewegungssystem zu verstehen.
