Die Arbeit wurde vom Elizabethtown College (R.J.W., M.L. und L.M.), durch ein NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) und von der Yale School of Medicine (N.A.) unterstützt.

Alle Experimente wurden gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und sowohl vom Elizabethtown College als auch vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Dieses Protokoll ist spezifisch für die anästhesierte Rattenvorbereitung unter Verwendung von CIS-FSCV.
1. Vorchirurgische Vorbereitungen
<ol><li>Vorbereitung der Elektrodenlösung<ol>
<li>Um die Elektrodenverfülllösung herzustellen, wird eine Lösung aus 4 M Kaliumacetat mit 140 mM Kaliumchlorid16 hergestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrodenvorbereitung<ol>
<li>Mittels Vakuumabsaugung wird eine T-650 Kohlefaser (7 μm Durchmesser) in eine Borosilikatglaskapillare eingebracht (Länge = 100 mm, Durchmesser = 1,0 mm, Innendurchmesser = 0,5 mm).</li>
		<li>Sobald die Kohlefaser in die Glaskapillare gelegt wurde, legen Sie die Glaskapillar in einen vertikalen Elektrodenabzieher, wobei das Wärmeelement ungefähr in der Mitte der Kapillare liegt. Stellen Sie die Heizung bei ausgeschaltetem Magneten auf 55.</li>
		<li>Nachdem die Kapillare gezogen wurde, heben Sie den oberen Kapillarhalter vorsichtig an, damit die Spitze der Elektrode nicht vom Heizelement umgeben ist.</li>
		<li>Schneiden Sie mit einer scharfen Schere die Kohlefaser ab, die noch die beiden Teile der Kapillare verbindet. Dies wird zu zwei separaten Kohlefaser-Mikroelektroden führen.</li>
		<li>Schneiden Sie unter einem Lichtmikroskop die freiliegende Kohlefaser vorsichtig mit einem scharfen Skalpell ab, so dass sich die Kohlefaser etwa 75-100 μm über das Ende des Glases hinaus erstreckt.</li>
		<li>Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop sicher, dass die Elektrode frei von Rissen entlang der Kapillare ist. Achten Sie auch darauf, dass die Dichtung, bei der die Kohlefaser aus der Kapillare austritt, schwer zu bemerken und frei von Rissen ist. HINWEIS: Eine gute Abdichtung hilft, Rauschen während der Aufnahmen zu reduzieren. Siehe veröffentlichte Studien17,18,19 für ein detaillierteres Protokoll.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Referenzelektroden<ol>
<li>Löten Sie einen Goldstift an einen 5 cm großen Silberdraht.</li>
		<li>Befestigen Sie die Anode an einer Metallklammer oder einem anderen Leiter, die Kathode an einem Stift und legen Sie eine Spannung (~ 2 V) an, während die Büroklammer und der Silberdraht in 0,1 M HCl eingetaucht sind.</li>
		<li>Stoppen Sie die Spannung, sobald eine weiße Beschichtung (AgCl) auf dem Silberdraht erscheint.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrode für die Implantation vorbereiten<ol>
<li>Löten Sie einen Goldstift an einen dünnen isolierten Draht (~10 cm Länge, <0,50 mm Durchmesser).</li>
		<li>Entfernen Sie ~ 5 cm Isolierung von dem Draht gegenüber dem Goldstift.</li>
		<li>Füllen Sie die Elektrode etwa zur Hälfte mit Elektrodenlösung.</li>
		<li>Legen Sie einen isolierten Draht in die Elektrode ein. HINWEIS: Der Draht sollte Kontakt mit der Kohlefaser in der Elektrode aufnehmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Elektrodenimplantationen
<ol><li>Geben Sie erwachsenen, männlichen Sprague Dawley Ratten (250−450 g) eine intraperitoneale Injektion (1,5 g/kg oder 1 ml/kg Volumen) von 0,5 g/ml Urethan gelöst in steriler Kochsalzlösung. Beginnen Sie mit einer Urethan-Anfangsdosis von 1,0−1,2 g/kg. Wenn das Tier 20 minuten nach der Verabreichung von Urethan noch auf den Schadstoffreiztest (Schwanzklemme) anspricht, verabreichen Sie zusätzlich 0,3−0,5 g/kg Urethan für eine Gesamtdosis von 1,5 g/kg. ANMERKUNG: Zur Herstellung der 0,5 g/ml Urethanlösung werden 10 g Urethan zu 10 g (~10 ml) Kochsalzlösung gegeben. Urethan ist ein Karzinogen und muss mit Vorsicht behandelt werden. Urethan ist ein wichtiges Anästhetikum, da es den Dopaminspiegel nicht verändert, ebenso wenig wie andere Anästhetika wie Ketamin / Xylazin und Chloralhydrat20,21.</li>
	<li>Sobald das Tier tief betäubt ist und nicht auf schädliche Reize (z. B. Zehendrücken) reagiert, legen Sie es in den stereotaktischen Rahmen. Tragen Sie ophthalmologisches Gleitmittel auf jedes Auge der Ratte auf. HINWEIS: Dies ist eine Nicht-Überlebensoperation, aber eine gute aseptische Technik wird empfohlen.</li>
	<li>Reinigen Sie die Kopfhaut der Ratte mit einem zweistufigen Peeling (d. H. Ein Iodopovidon-Peeling, gefolgt von einem 70% igen Ethanol-Peeling; führen Sie es mit einer Wiederholung von 3 Zyklen durch).</li>
	<li>Schneiden Sie das Kopfhautgewebe mit einer sterilisierten Nadelnasenpinzette und einer chirurgischen Schere weg. Entfernen Sie eine beträchtliche Menge an Gewebe, um Platz für die verschiedenen unten beschriebenen Implantationen zu schaffen.</li>
	<li>Reinigen Sie die Schädeloberfläche vorsichtig mit sterilisierten Applikatoren aus Baumwolle. Tragen Sie dann 2-3 Tropfen 3% Wasserstoffperoxid auf, um lambda und bregma zu identifizieren.</li>
	<li>Bohren Sie mit einem Stereotaxie- oder Handbohrer (1,0 mm, ~ 20.000 U / min) ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 2,5 mm vor dem Bregma und 3,5 mm seitlich vor dem Bregma. Teilweise (etwa auf halbem Weg, bis es fest an Ort und Stelle ist) implantieren Sie eine Schraube (1,59 mm O.D., 3,2 mm lang) in dieses Loch. Es wird empfohlen, sterile Kochsalzlösung zu verwenden, um während des Bohrens zu bewässern, um thermische Verletzungen zu vermeiden.</li>
	<li>Bohren Sie für die Referenzelektrode ein Loch mit einem Durchmesser von 1,0 mm, 1,5 mm anterior und 3,5 mm seitlich zum Bregma in der linken Hemisphäre.</li>
	<li>Führen Sie von Hand ~ 2 mm Referenzdraht in dieses Loch ein, während Sie den Referenzdraht um und unter den Kopf der implantierten Schraube wickeln.</li>
	<li>Implantieren Sie die Schraube vollständig und befestigen Sie die Referenzelektrode an Ort und Stelle.</li>
	<li>Bohren Sie in der rechten Hemisphäre ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 1,2 mm anterior und 1,4 mm seitlich zum Bregma.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einer Pinzette.</li>
	<li>Für die Stimulierende Elektrode bohren Sie ein quadratisches Loch (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral), zentriert bei 5,2 mm posterior und 1,0 mm lateral zum Bregma.</li>
	<li>Senken Sie mit den stereotaktischen Armstangen die bipolare stimulierende Elektrode / Führungskanüle 5 mm unter die Dura. Im Falle von Blutungen während der Implantation der Elektrode verwenden Sie sterile Wattestäbchen und Gaze, um Blutungen zu minimieren. HINWEIS: Die bei diesem Verfahren verwendete bipolare Stimulationselektrode ist mit einer Führungskanüle vorgerüstet (Materialtabelle). Die mit diesem Artikel verwendete interne Kanüle sollte mit den Zinken an der bipolaren Stimulationselektrode gespült werden, wenn sie vollständig in die Führungskanüle eingeführt ist. Dadurch kann die innere Kanüle direkt zwischen den beiden Zinken des Stimulators sitzen, die etwa 1 mm voneinander entfernt sitzen. Ein ähnliches Protokoll ist an anderer Stelle beschrieben14.</li>
	<li>Senken Sie mit den stereotaktischen Armstangen die Kohlefaser-Mikroelektrode 4 mm unter die Dura. Diese Lage befindet sich im dorsalsten Teil des Striatums.</li>
	<li>Verbinden Sie den Referenzdraht und die Kohlefaser mit einem Potentiostaten.</li>
	<li>Wenden Sie eine dreieckige Wellenform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) für 15 min bei 60 Hz und erneut für 10 min bei 10 Hz an. HINWEIS: Typischerweise werden beim Anlegen von Wellenformen auf Kohlefasermikroelektroden im Gehirn Oxidgruppen zur Oberfläche der Kohlefaser hinzugefügt. Das Gleichgewicht dieser Reaktion muss vor der Aufzeichnung erreicht werden; Andernfalls kommt es zu einer signifikanten Drift19. Das Durchlaufen der Elektrode bei höheren Frequenzen (60 Hz) ermöglicht es der Kohlefaser, schneller ein Gleichgewicht zu erreichen.</li>
</ol>3. Optimierung der Kohlefaser und Stimulierung der Elektroden- / Führungskanülenpositionen
<ol><li>Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er eine bipolare elektrische Wellenform mit einer Frequenz von 60 Hz, 24 Impulsen, 300 μA Strom und einer Pulsbreite von 2 ms / Phase erzeugt.</li>
	<li>Senken Sie den Stimulator vorsichtig in Schritten von 0,2 mm von 5 mm bis 7,8 mm unter die Dura. Stimulieren Sie bei jedem Schritt den VTA. HINWEIS: In mehr dorsalen Tiefen (5-6 mm) führt die Stimulation des Gehirns typischerweise (~ 80% der Zeit) dazu, dass die Schnurrhaare der Ratte zucken. In weiteren Tiefen hören die Schnurrhaare auf zu zucken, was zwischen 7,5 und 8,2 mm unterhalb der Dura auftritt. Wenn die Schnurrhaare aufhören zu zucken, befindet sich die stimulierende Elektrode in der Nähe oder am VTA. Dies tritt nicht bei jeder Ratte auf, und das Fehlen von Schnurrhaarzucken sollte nicht als Zeichen dafür angesehen werden, dass die bipolare stimulierende Elektrode / Infusionskanüle verlegt ist. Whisker-Zuckungen treten möglicherweise nicht bei allen Anästhetika (z. B. Isofluran) auf.</li>
	<li>Senken Sie die bipolare stimulierende Elektrode / Leitkanüle weiter ab, bis eine Stimulation eine phasische DA-Freisetzung an der Kohlefasermikroelektrode (derzeit im dorsalen Striatum) erzeugt. HINWEIS: Die DA-Freisetzung im dorsalen Striatum tritt nicht immer auf, wenn die bipolare Elektrode in die VTA implantiert wird, aber die Beobachtung der DA-Freisetzung im dorsalen Striatum bei VTA-Stimulation ist normalerweise ein gutes Zeichen dafür, dass ein gutes Signal im NAc-Kern beobachtet wird.</li>
	<li>Senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode ab, bis sie mindestens 6,0 mm unter der Dura liegt. Dies ist der dorsalste Teil des NAc-Kerns.</li>
	<li>Stimulieren Sie den VTA und zeichnen Sie die Spitzenamplitude des DA-Peaks auf.</li>
	<li>Senken oder heben Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode an der Stelle an, die die größte DA-Freisetzung erzeugt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Spitze der DA-Reaktion eine klare Oxidationsspitze bei 0,6 V und eine Reduktionsspitze bei -0,2 V ist. Diese Spitzen sind ein Hinweis auf DA.</li>
</ol>4. Kombinationsinfusion und Stimulation FSCV-Aufzeichnung
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste für die Aufzeichnung vor und nach der VTA-Mikroinfusion.
<ol><li>Sobald die Position der Kohlefaser und der stimulierenden Elektrode / Führungskanüle optimiert wurde, stimulieren Sie für ~ 20−30 min. HINWEIS: Stimulieren Sie unter den aktuellen Stimulationsparametern nicht mehr als einmal alle 3 Minuten, um ein vesikuläres Nachladen zu ermöglichen22.</li>
	<li>Nach Erreichen einer stabilen Baseline (<20% Variation über fünf Stimulationen) senken Sie die innere Kanüle vorsichtig von Hand in die Führungskanüle, die in den bipolaren Stimulator vormontiert ist.</li>
	<li>Machen Sie zusätzliche 2−3 Baseline-Aufnahmen, um sicherzustellen, dass die Kanüleneinführung selbst keine Veränderung des evozierten Signals verursachte. In einigen Fällen kann das Einsetzen und Entfernen der inneren Kanüle zu Schäden an der VTA führen. Wenn sich das Signal während dieser Baseline-Periode drastisch ändert (>20%), dann nehmen Sie weitere 3-4 Aufnahmen auf, bis sich die Baseline wieder stabilisiert.</li>
	<li>Mit einer Spritzenpumpe und einer Mikrospritze werden über einen Zeitraum von 2 Minuten 0,5 μL Lösung (z. B. 0,9% Kochsalzlösung, N-Methyl-D-Aspartat [NMDA], (2R)-Amino-5-phosphonovalerinsäure [AP5]) in die VTA eingebracht.</li>
	<li>Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion mindestens 1 Minute vor der Entfernung stehen. HINWEIS: Einige Medikamente erfordern möglicherweise, dass die interne Kanüle basierend auf der Arzneimittelkinetik für eine längere Zeit verlassen wird, und die Entfernung der internen Kanüle kann dazu führen, dass das Medikament durch die innere Kanüle wieder nach oben wandert. Wenn es Bedenken gibt, könnte man die interne Kanüle während der gesamten Aufnahme in der Führungskanüle belassen. Andernfalls kann die Aufzeichnung nach diesem 1-minütigen Intervall beginnen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Aufzeichnung alle 3 Minuten fort, um die Effekte nach der Infusion zu messen. HINWEIS: Wenn eine Kontrolllösung infundiert wird und keine Wirkung beobachtet wird, ist es möglich, ein zweites Mal zu infundieren10. Wenn es zu einer veränderten DA-Freisetzung kommt, die durch das Einsetzen der internen Kanüle oder der Kochsalzlösung verursacht wird, erholt sich das Signal typischerweise innerhalb von 30 Minuten auf den Ausgangswert.</li>
</ol>5. Histologische Überprüfung der Elektrodenplatzierung
<ol><li>Am Ende des Experiments erzeugen Sie eine kleine Läsion an der Aufnahmestelle mit der Kohlefaser-Mikroelektrode.<ol>
<li>Wenn die Elektrode für die Kalibrierung nach dem Experiment erhalten bleiben muss, verwenden Sie einen Wolframdraht, der in einer Glaskapillare platziert ist, die ~ 100 μm über die Kapillarspitze hinausragt. Heben Sie in diesem Fall die Elektrode aus dem Gehirn an, ersetzen Sie die Aufnahmeelektrode durch die Wolframelektrode und senken Sie sie auf die gleiche dorsoventrale Koordinate. HINWEIS: Die Kohlefaser kann auch verwendet werden, um das Gehirn zu läsionieren und liefert eine genauere Darstellung der Position der Aufnahmestelle; Der Experimentator verliert jedoch die Fähigkeit, diese Elektroden zu kalibrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Aufnahmestelle zu läsionieren, wenden Sie die Spannung mit einem Netzteil an. Beginnen Sie bei 1 V und erhöhen Sie alle 10 s um 1 V, bis 10 V erreicht ist.</li>
	<li>Das Tier wird mit einer tödlichen intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (150 mg/kg) eingeschläfert.</li>
	<li>Perfuse die Ratte mit einer 4% igen Formalinlösung.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kopf von der Ratte mit einer geschärften Guillotine.</li>
	<li>Entfernen Sie mit Rongeurs das Bindegewebe und den Schädel, die das Gehirn umgeben, und entfernen Sie das Gehirn sanft von verbleibendem Gewebe.</li>
	<li>Lagern Sie das Gehirn in 4% Formalin für 1 Tag und übertragen Sie es dann auf 30% Saccharose. HINWEIS: Eine Perfusion mit 4% Formalin ist nicht notwendig, um die Läsionsstelle zu sehen, obwohl sie als Best Practice die Rekonstruktion der Läsionsstelle verbessert.</li>
	<li>Erstellen Sie 30 μm Scheiben des Gehirns mit einem Kryostaten.</li>
	<li>Montieren Sie die Scheiben auf Dias und bedecken Sie sie mit einem Abdeckzettel.</li>
	<li>Bezeichnen Sie die Lage der Kohlefaser-Mikroelektrodenläsion und die Bipolarstimulator- / Infusionskanülenposition mit einem Lichtmikroskop.</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+Dopamine+Signals+in+the+Nucleus+Accumbens+that+Cause+Active+Avoidance+Require+Endocannabinoid+Mobilization+in+the+Midbrain.">Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain.</a> Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).</li><li>Spanos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptor-Dependent+Cholinergic+Modulation+of+Mesolimbic+Dopamine+Cell+Bodies:+Neurochemical+and+Behavioral+Studies.">NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).</li><li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+enhance+subsecond+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats.">Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats.</a> Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).</li><li>Melchior, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+versus+electrical+stimulation+of+dopamine+terminals+in+the+nucleus+accumbens+reveals+local+modulation+of+presynaptic+release.">Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release.</a> Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies,+Fish,+and+Mice.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li><li>Robinson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+rapid+chemical+communication+in+the+brain.">Monitoring rapid chemical communication in the brain.</a> Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+extracellular+dopamine+regulation+in+the+subregions+of+the+olfactory+tubercle.">Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).</li><li>Ganesana, M., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+transient+adenosine+during+cerebral+ischemia+and+reperfusion+injury.">Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury.</a> PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

CIS-FSCV bietet eine einzigartige Gelegenheit, die VTA-Rezeptormechanismen zu untersuchen, die der phasischen DA-Freisetzung zugrunde liegen. Es gibt zwei kritische Schritte, um eine ordnungsgemäße Aufzeichnung zu gewährleisten. Zunächst muss eine stabile Baseline-Aufzeichnung erreicht werden, mit wenig Drift im evozierten DA-Signal. Eine wichtige Möglichkeit, die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Aufzeichnung zu erhöhen, besteht darin, sicherzustellen, dass die Elektrode genügend Zeit hatte, sowohl bei 60 Hz als ...

Die freisetzung von phasischem Dopamin (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens (NAc) spielt eine wichtige Rolle bei belohnungsbezogenen Verhaltensweisen. VTA DA-Neuronen wechseln von einem tonischartigen Feuer (3-8 Hz) zu einem Burst-ähnlichen Feuer (>14 Hz)1, was eine phasische DA-Freisetzung im NAc erzeugt. Der VTA exprimiert eine Vielzahl von somatodendritischen Rezeptoren, die gut positioniert sind, um den Wechsel von tonisch zu burstfeuern2,3,4,5zusteuern. Die Identifizierung, welcher dieser Rezeptoren und ihre jeweiligen Eingaben die phasische DA-Freisetzung steuern, wird unser Verständnis dafür vertiefen, wie die belohnungsbezogene Schaltung organisiert ist. Der Zweck der hier beschriebenen Methodik, kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Schnellscan-Voltammetrie (CIS-FSCV), besteht darin, die Funktionalität von VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung schnell und robust zu bewerten.
Der Begriff kombinierte Infusion und Stimulation (CIS) bezieht sich auf die pharmakologische Manipulation von Rezeptoren auf einer Gruppe von Neuronen (hier die VTA) und die Stimulierung dieser Neuronen, um die Funktion des Rezeptors zu untersuchen. Bei der betäubten Ratte stimulieren wir die VTA elektrisch, um ein großes phasisches DA-Signal (1-2 μM) im NAc-Kern hervorzurufen, gemessen durch zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Infusionen von pharmakologischen Medikamenten (d.h. Rezeptoragonisten/-antagonisten) an der Stimulationsstelle können verwendet werden, um die Funktion von VTA-Rezeptoren zu messen, indem die nachfolgende Veränderung der evozierten phasischen DA-Freisetzung beobachtet wird. FSCV ist ein elektrochemischer Ansatz, der sowohl eine hohe räumliche (50-100 μm) als auch eine zeitliche (10 Hz) Auflösung aufweist und sich gut für die Messung belohnungsbezogener, phasischer DA-Ereignisseeignet 6,7. Diese Auflösung ist feiner als andere neurochemische In-vivo-Messungen, wie z.B. Mikrodialyse. Daher ist CIS-FSCV zusammen gut geeignet, um die VTA-Rezeptorregulation der phasischen Dopaminfreisetzung zu beurteilen.
Eine gängige Methode zur Untersuchung der VTA-Rezeptorfunktion ist die Verwendung einer Kombination elektrophysiologischer Ansätze, die untersuchen, wie diese Rezeptoren die Feuerrate von Neuronen verändern1,8. Diese Studien sind sehr wertvoll, um zu verstehen, welche Rezeptoren daran beteiligt sind, DA bei Aktivierung anzutreiben. Diese Studien können jedoch nur darauf hindeuten, was stromabwärts am Axonterminal passieren könnte (d. H. Freisetzung eines Neurotransmitters). CIS-FSCV baut auf diesen elektrophysiologischen Studien auf, indem es beantwortet, wie die Ausgabe von VTA-Burst-Feuerung, phasischer DA-Freisetzung, durch Rezeptoren reguliert wird, die sich auf VTA-Dendriten und Zellkörpern befinden. Cis-FSCV ist daher gut geeignet, um auf diesen elektrophysiologischen Studien aufzubauen. Als Beispiel kann die Nikotinrezeptoraktivierung das Burst-Feuern im VTA9induzieren, und CIS-FSCV in der anästhesierten Ratte wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) in der VTA auch die phasische DA-Freisetzung im NAc10steuert,11.
Die mechanistische Untersuchung der phasischen DA-Regulation wird auch häufig mit Slice-Präparaten zusammen mit der Anwendung von Medikamenten untersucht. Diese Studien konzentrieren sich oft auf die präsynaptische Regulation der phasischen DA-Freisetzung von Dopaminterminalen, da die Zellkörper oft aus derScheibe 12entfernt werden. Diese Präparate sind wertvoll für die Untersuchung präsynaptischer Rezeptorwirkungen auf Dopaminterminale, während CIS-FSCV besser geeignet ist, um somatodendritische Rezeptorwirkungen auf Dopaminneuronen sowie präsynaptische Inputs in die VTA zu untersuchen. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die Aktivierung des somatodendritischen Rezeptors im VTA einen anderen Effekt haben kann als die Aktivierung des präsynaptischen NAc-Rezeptors. Tatsächlich kann die Blockierung dopaminerger präsynaptischer nAChRs im NAc die phasische Dopaminfreisetzung während des Burst-Firings13erhöhen, während das Gegenteil bei VTA somatodendritc nAChRs10,11der Fall ist.
CIS-FSCV ist ein idealer Ansatz, um die Fähigkeit von VTA-Rezeptoren zu untersuchen, die phasische DA-Freisetzung zu regulieren. Wichtig ist, dass dieser Ansatz bei einer intakten Ratte durchgeführt werden kann, entweder betäubt oder sich frei bewegend. Dieser Ansatz eignet sich für akute Studien, zur Untersuchung der Rezeptorfunktion im Ausgangszustand10,14 sowie für Langzeitstudien, die funktionelle Veränderungen in einem Rezeptor nach Arzneimittelexposition oder Verhaltensmanipulation beurteilen können11,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Electrode Filling Solution/Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF286-5 (28 gauge)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>236497-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fiber</td>
			<td>Thornel</td>
			<td>T650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Narishige International</td>
			<td>PE-22</td>
			<td>Note: horizontal pullers can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>626000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated wires for electrodes</td>
			<td>Weico Wire and Cable Incorporated</td>
			<td>UL 1423</td>
			<td>Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope (for viewing and cutting electrode)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin</td>
			<td>Phoenix Enterprises</td>
			<td>HWS1646</td>
			<td>To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putty</td>
			<td>Alcolin</td>
			<td><a target="_blank" href="https://www.dickblick.com/items/23922-1003/">23922-1003</a></td>
			<td>Used to place electrode on while cutting the carbon fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpal Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting carbon fiber to the apprpriate length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>327026-4G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSCV Hardware/Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>U-Line</td>
			<td>H-3618 (36&#34; x 24&#34; x 42&#34;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating electrode</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>MS303/2-A/SPC</td>
			<td>when ordering, request a 22 mm cut below pedestal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TarHeel HDCV Software</td>
			<td>University of North Carolina-Chapel Hill</td>
			<td>-</td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEI breakout box</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEI power supply</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog stimulus isolator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS4</td>
			<td>Neurolog 800A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/Stimulation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion Pump</td>
			<td>New Era Syringe Pump</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>C315I/SPC INTERNAL 33GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1776 P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>29906-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Bone Anchor Screws/Pkg.of 100</td>
			<td>1.59 mm O.D., 3.2 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire reference with AgCl</td>
			<td>InVivo Metric</td>
			<td>E255A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Gauze</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>441408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 902 (Dual Arm Bar)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BK Precision</td>
			<td>9110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>80497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten microelectrode</td>
			<td>MicroProbes</td>
			<td>WE30030.5A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for infusions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scopolamine hydrobromide (S0929-1g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined infusion and stimulation with fast-scan cyclic voltammetry (cis-fscv) to assess ventral tegmental area receptor regulation of phasic dopamine

Die phasische Dopaminausschüttung (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens spielt eine zentrale Rolle bei der Belohnungsverarbeitung und beim reinforcementden Lernen. Zu verstehen, wie die verschiedenen neuronalen Eingaben in die phasische DA-Freisetzung der VTA-Kontrolle ein besseres Bild der Schaltkreise liefern können, die die Belohnungsverarbeitung und das Verstärkungslernen steuern. Hier beschreiben wir eine Methode, die Intra-VTA-Kanüleninfusionen von pharmakologischen Agonisten und Antagonisten mit stimulationshergerufener phasischer DA-Freisetzung (kombinierte Infusion und Stimulation oder CIS) kombiniert, gemessen durch in vivo zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Unter Verwendung von CIS-FSCV bei anästhesierten Ratten kann eine phasische DA-Reaktion hervorgerufen werden, indem die VTA mit einer bipolaren Elektrode, die mit einer Kanüle versehen ist, während im Kern des Nucleus accumbens elektrisch stimuliert wird. Pharmakologische Agonisten oder Antagonisten können direkt an der Stimulationsstelle infundiert werden, um die Rolle spezifischer VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung zu untersuchen. Ein großer Vorteil von CIS-FSCV besteht darin, dass die VTA-Rezeptorfunktion in vivo untersucht werden kann, aufbauend auf In-vitro-Studien.

CIS-FSCV wurde verwendet, um die Funktion von VTA-N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (mAChRs) bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung im NAc-Kern zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten für eine Negativkontrolle, Infusion von 0,9% Kochsalzlösung, vor (Baseline) und 9 min nach der Infusion (Kochsalzlösung). Abbildung 2</...

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Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ventrale tegmentale Bereichsrezeptoren direkt zu manipulieren, um ihren Beitrag zur Subsekunden-Dopaminfreisetzung zu untersuchen.

Kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Fast-Scan-Voltammetrie (CIS-FSCV) zur Beurteilung der ventralen Tegmental-Area-Rezeptor-Regulation von phasischem Dopamin

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...

combined-infusion-stimulation-with-fast-scan-cyclic-voltammetry-cis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

3.0K Aufrufe.  Elizabethtown College. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ventrale tegmentale Bereichsrezeptoren direkt zu manipulieren, um ihren Beitrag zur Subsekunden-Dopaminfreisetzung zu untersuchen.

Serie: Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

Die Kombination TMS und fMRT dem Standard-Modus Netzwerk Untersuchen

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Forschung

Neurowissenschaften

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive procedures, and can be used to monitor electrode performance over the long term. EIS measures electrical impedance at multiple frequencies, and increases in impedance indicate increased glial scar formation around the device, while cyclic voltammetry measures the charge carrying capacity of the electrode, and indicates how charge is transferred at different voltage levels. As implanted electrodes age, EIS and CV data change, and electrode sites that previously recorded spiking neurons often exhibit significantly lower efficacy for neural recording. The application of a brief voltage pulse to implanted electrode arrays, known as rejuvenation, can bring back spiking activity on otherwise silent electrode sites for a period of time. Rejuvenation alters EIS and CV, and can be monitored by these complementary methods. Typically, EIS is measured daily as an indication of the tissue response at the electrode site. If spikes are absent in a channel that previously had spikes, then CV is used to determine the charge carrying capacity of the electrode site, and rejuvenation can be applied to improve the interface efficacy. CV and EIS are then repeated to check the changes at the electrode-tissue interface, and neural recordings are collected. The overall goal of rejuvenation is to extend the functional lifetime of implanted arrays.

The electrode-tissue interface of neural recording electrodes can be characterized with electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV). Application of voltage biasing changes the electrochemical properties of the electrode-tissue interface and can improve recording capability. Voltage biasing, EIS, CV, and neural recordings are complementary.

Vorspannschaltung, Cyclovoltammetrie, Impedanzspektroskopie &amp; Elektrotechnik für Neuronale Interfaces

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Modeling Fast-scan Cyclic Voltammetry Data from Electrically Stimulated Dopamine Neurotransmission Data Using QNsim1.0

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is implicated in diseases and disorders including attention deficit hyperactivity disorder, Parkinson's disease, and traumatic brain injury. Thus, DA neurotransmission and the methods to study it are of intense scientific interest. In vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) is a method that allows for selectively monitoring DA concentration changes with fine temporal and spatial resolution. This technique is commonly used in conjunction with electrical stimulations of ascending DAergic pathways to control the impulse flow of dopamine neurotransmission. Although the stimulated DA neurotransmission paradigm can produce robust DA responses with clear morphologies, making them amenable for kinetic analysis, there is still much debate on how to interpret the responses in terms of their DA release and clearance components. To address this concern, a quantitative neurobiological (QN) framework of stimulated DA neurotransmission was recently developed to realistically model the dynamics of DA release and reuptake over the course of a stimulated DA response. The foundations of this model are based on experimental data from stimulated DA neurotransmission and on principles of neurotransmission adopted from various lines of research. The QN model implements 12 parameters related to stimulated DA release and reuptake dynamics to model DA responses. This work describes how to simulate DA responses using QNsim1.0 and also details principles that have been implemented to systematically discern alterations in the stimulated dopamine release and reuptake dynamics.

Fast-scan cyclic voltammetry can monitor in vivo dopamine neurotransmission in the context of drugs, disease, and other experimental manipulations. This work describes the implementation of QNsim1.0, a software to model electrically stimulated dopamine responses according to the quantitative neurobiological model to quantify estimates of dopamine release and reuptake dynamics.

Modellierung Fast-Scan Zyklische Voltammetrie Daten aus elektrisch stimulierten Dopamin Neurotransmission Daten mit QNsim1.0

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is ...