작업은 엘리자베스 타운 대학 (R.J.W, M.L., 그리고 L.M.), NSF 대학원 펠로우십 (R.J.W.) 및 예일 의과 대학 (N.A.)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 엘리자베스 타운 대학과 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 CIS-FSCV를 활용하는 마취 된 쥐 준비에 특정합니다.
1. 외과 전 준비
<ol><li>전극 용액 준비<ol>
<li>전극 백필 용액을 만들기 위해 염화 16140mM 칼륨으로 아세테이트 4M의 용액을 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전극 준비<ol>
<li>진공 흡입을 사용하여 T-650 탄소 섬유 (직경 7 μm)를 borosilicate 유리 모세관 (길이 = 100mm, 직경 = 1.0mm, 내부 직경 = 0.5 mm)에 삽입하십시오.</li>
		<li>탄소 섬유가 유리 모세관 내부에 놓이면 유리 모세관을 수직 전극 풀러에 넣고 열 원소는 모세관 한가운데에 대략 배치합니다. 자석을 끄고 히터를 55로 설정합니다.</li>
		<li>모세관을 당긴 후, 전극의 끝이 가열 요소에 의해 포위되지 않도록 조심스럽게 상부 모세관 홀더를 올립니다.</li>
		<li>날카로운 가위를 사용하여 여전히 모세관의 두 조각을 연결하는 탄소 섬유를 잘라냅니다. 이로 인해 두 개의 분리된 탄소 섬유 미세 전극이 발생합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경하에서, 탄소 섬유가 유리 끝을 넘어 약 75-100 μm를 확장되도록 날카로운 메스로 노출된 탄소 섬유를 조심스럽게 잘라냅니다.</li>
		<li>가벼운 현미경을 사용하여 전극이 모세관을 따라 균열이 없는지 확인하십시오. 또한 탄소 섬유가 모세관을 빠져나가는 씰이 눈치채기 어렵고 균열이 없도록 하십시오. 참고: 좋은 씰은 녹음 중 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다. 보다 상세한프로토콜은17,18,19에 게재된 연구를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기준 전극 제조<ol>
<li>5cm 실버 와이어에 골드 핀을 납땜.</li>
		<li>양극을 금속 종이 클립 또는 다른 도체, 음극에 핀에 부착하고, 종이 클립과 실버 와이어가 0.1 M HCl에 침수되는 동안 전압(~2V)을 적용합니다.</li>
		<li>백색 코팅(AgCl)이 실버 와이어에 나타나면 전압을 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이식용 전극 준비<ol>
<li>얇은 절연 와이어에 금 핀을 납땜 (길이 10cm, <0.50 mm 직경).</li>
		<li>골드 핀 맞은편 와이어에서 절연 ~5cm를 제거합니다.</li>
		<li>전극 용액의 중간쯤에 전극을 채웁니다.</li>
		<li>절연 와이어를 전극에 삽입합니다. 참고: 와이어는 전극 내부의 탄소 섬유와 접촉해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 전극 이식
<ol><li>성인, 남성, 스프라그 Dawley 쥐 (250-450 g) 멸균 식염수에 용해 된 0.5 g/mL 우레탄의 인트라피오네 주사(1.5 g/kg 또는 1mL/kg 부피)를 준다. 1.0-1.2 g/kg의 초기 우레탄 복용량으로 시작합니다. 동물이 우레탄 투여 후 20분 동안 유해 자극 테스트(tail pinch)에 여전히 반응하는 경우 총 용량 1.5g/kg의 요르탄을 추가로 투여하십시오. 참고: 0.5 g/mL 우레탄 용액을 준비하려면 식염수 10g(~10mL)에 우레탄 10g을 넣습니다. 우레탄은 발암 물질이며 주의해야 합니다. 우레탄은 케타민/자일라진 및 클로랄 수화물20,21과같은 다른 마취제와 마찬가지로 도파민의 수준을 변경하지 않기 때문에 중요한 마취제이다.</li>
	<li>동물이 심하게 마취되고 유해 성 자극 (예 : 발가락 핀치)에 반응하지 않는 경우, 스테레오 탁스 프레임에 놓습니다. 쥐의 각 눈에 안과 윤활유를 바르습니다. 참고 : 이것은 비 생존 수술이지만 좋은 무균 기술이 권장됩니다.</li>
	<li>2단 스크럽(즉, 요오도포비도 스크럽, 70% 에탄올 스크럽, 3주기 반복으로 수행)을 사용하여 쥐의 두피를 청소하십시오.</li>
	<li>멸균 된 바늘 코 핀셋과 수술 가위를 사용하여 두피 조직을 잘라냅니다. 아래에 설명된 다양한 이식을 위한 공간을 만들기 위해 상당한 양의 조직을 제거하십시오.</li>
	<li>살균 된 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골 표면을 부드럽게 청소하십시오. 그런 다음 과산화수소 3 %의 2-3 방울을 적용하여 람다와 브레그마를 식별하십시오.</li>
	<li>스테레오탁스 또는 핸드 드릴(1.0mm, ~20,000rpm)을 사용하여 1.5mm 직경의 구멍을 브레그마에 2.5mm 전방으로 드릴링하고 3.5mm 측면을 브레그마로 드릴링합니다. 이 구멍에 나사(1.59mm O.D., 3.2mm 길이)를 부분적으로 이식합니다( 중간 정도, 제자리에 단단히 고정될 때까지). 열 손상을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 관개멸식 식염수식을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>기준 전극의 경우, 1.0mm 직경 구멍 1.5mm 전방 및 3.5mm 측면을 왼쪽 반구의 bregma에 드릴링합니다.</li>
	<li>손으로, 이식 된 나사의 머리 주위에 및 머리 아래에 참조 와이어를 감싸면서,이 구멍에 기준 와이어의 ~ 2mm를 삽입합니다.</li>
	<li>나사를 완전히 이식하여 기준 전극을 제자리에 고정시합니다.</li>
	<li>오른쪽 반구에서, 1.5mm 직경 구멍 1.2 mm 전방 및 1.4 mm 측면 bregma에 드릴.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 듀라를 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>자극전극의 경우 5.2mm 후방을 중심으로 한 사각형 구멍(전방 후방 2mm, 내측 측측)을 드릴링하고 1.0mm 측면으로 브레그마에 배치합니다.</li>
	<li>스테레오전술 암 바를 사용하여 양극성 자극 전극/가이드 캐뉼라를 듀라 아래 5mm 아래로 낮춥춥시다. 전극이식 시 출혈이 있는 경우 멸균 면봉과 거즈를 사용하여 출혈을 최소화하십시오. 참고: 이 방법에 사용되는 양극성 자극 전극에는 가이드 캐뉼라(재료표)가미리 갖추어져 있습니다. 이 항목과 함께 사용되는 내부 캐뉼라는 가이드 캐뉼라에 완전히 삽입할 때 양극성 자극 전극의 갈래로 플러시되어야 합니다. 이렇게 하면 내부 캐뉼라가 약 1mm 떨어져 있는 자극제의 두 갈래 사이에 직접 앉을 수 있습니다. 유사한 프로토콜은 다른 곳에서설명된다 14.</li>
	<li>스테레오전술 암 바를 사용하여 듀라 아래 탄소 섬유 미세 전극을 4mm 낮춥춥시다. 이 위치는 줄무늬의 가장 등쪽 부분에 있습니다.</li>
	<li>레퍼런스 와이어와 탄소 섬유를 강력한 iostat에 연결합니다.</li>
	<li>60Hz에서 15분, 10Hz에서 10분 동안 삼각형 파 형태(-0.4-1.3V, 400 V/s)를 적용합니다. 참고: 전형적으로, 뇌의 탄소 섬유 미세 전극에 파형을 적용할 때, 산화물 그룹은 탄소 섬유의 표면에 추가됩니다. 이 반응의 평형은 기록하기 전에 도달해야합니다; 그렇지 않으면 상당한 드리프트가발생합니다 19. 더 높은 주파수(60Hz)에서 전극을 사이클링하면 탄소 섬유가 평형을 더 빠르게 달성할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 탄소 섬유 최적화 및 자극 전극 /가이드 캐뉼라 위치
<ol><li>자극기를 설정하여 60Hz, 24펄스, 300 μA 전류 및 2ms/phase의 펄스 폭을 가진 양극성 전기 파형을 생성합니다.</li>
	<li>자극기를 5mm에서 7.8mm로 0.2mm 단위로 부드럽게 낮춥시다. 각 증분에서 VTA를 자극합니다. 참고: 더 많은 등쪽 깊이 (5-6 mm)에서 뇌의 자극은 일반적으로 (시간의 ~ 80 %)는 쥐의 수염을 트위치로 유발합니다. 더 깊이에서, 수염은 두라 아래 7.5-8.2 mm 사이에서 발생하는 경련을 중단합니다. 수염이 경련을 멈추면 자극하는 전극이 VTA 에 가깝거나 VTA에 있을 것입니다. 이것은 모든 쥐에서 발생하지 않으며, 수염 경련의 부족은 양극성 자극 전극 / 주입 캐뉼라가 잘못 배치되어 있다는 표시로 받아들여서는 안됩니다. 수염 경련은 모든 마취제(예: 이소플루란)에 대해 발생하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>자극이 탄소 섬유 미세 전기 전극 (현재 등쪽 줄무늬)에서 완화 DA 방출을 생성 할 때까지 양극성 자극 전극 / 가이드 캐뉼라를 계속 낮춥니다. 참고: 등쪽 조각의 DA 방출은 양극성 전극이 VTA에 이식되는 경우 항상 발생하는 것은 아니지만 VTA 자극시 등쪽 점막에서 DA 방출을 관찰하는 것은 일반적으로 NAc 코어에서 좋은 신호가 관찰될 것이라는 좋은 신호이다.</li>
	<li>탄소 섬유 미세 전극을 듀라 아래 6.0mm 이상 될 때까지 낮춥다. 이것은 NAc 코어의 가장 등쪽 부분입니다.</li>
	<li>VTA를 자극하고 DA 피크의 피크 진폭을 기록합니다.</li>
	<li>가장 큰 DA 방출을 생성하는 현장에서 탄소 섬유 마이크로 전극을 낮추거나 올립니다.</li>
	<li>DA 응답의 피크가 0.6V에서 명확한 산화 피크와 -0.2 V의 감소 피크인지 확인합니다. 이 피크는 DA를 나타냅니다.</li>
</ol>4. 조합 주입 및 자극 FSCV 기록
참고: 그림 1은 VTA 마이크로인퓨전 전후에 기록할 타임라인을 보여 줍니다.
<ol><li>탄소 섬유와 자극 전극/가이드 캐뉼라 위치가 최적화되면 ~ 20-30 분 동안 자극하십시오. 참고: 현재 자극 매개 변수에서 3분마다 한 번 이상 자극하지 말고,22를다시 로드할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>안정적인 기준선(<20% 변형)을 달성한 후, 양극성 자극기로 미리 장착된 가이드 캐뉼라에 손으로 내부 캐뉼라를 부드럽게 낮춥니다.</li>
	<li>캐뉼라 삽입 자체가 호출된 신호의 변화를 일으키지 않도록 추가2-3 기준 기록을 가져 가라. 경우에 따라 내부 캐뉼라를 삽입하고 제거하면 VTA가 손상될 수 있습니다. 이 기준 기간(>20%)에 걸쳐 신호가 크게 변경되면 기준선이 다시 안정될 때까지 추가로 3-4 레코딩을 수행합니다.</li>
	<li>주사기 펌프와 미세 주사기를 사용하여 0.5 μL의 용액(예: 0.9% 식염수, N-메틸-D-아스파르타트 [NMDA], (2R)-아미노-5-인포노발레산[AP5])을 VTA에 2분 동안 주입한다.</li>
	<li>사후, 제거하기 전에 적어도 1 분 동안 내부 캐뉼라를 둡니다. 참고: 일부 약물은 약물 역학에 따라 더 긴 시간 동안 내부 캐뉼라를 떠나야 할 수 있으며, 내부 캐뉼라를 제거하면 약물이 내부 캐뉼라를 통해 다시 이동하게 될 수 있습니다. 우려가 있는 경우, 녹음 전체를 안내서 캐뉼라에 내부 캐뉼라를 남길 수 있습니다. 그렇지 않으면 이 1분 간격 후에 레코딩이 시작될 수 있습니다.</li>
	<li>3분마다 계속 기록하여 사후 효과를 측정합니다. 참고: 제어 솔루션을 주입하고 효과가 관찰되지 않으면 두 번째10을주입할 수 있습니다. 내부 캐뉼라 또는 식염수 주입을 삽입하여 발생하는 변경된 DA 방출이 있는 경우 신호는 일반적으로 30분 이내에 기준선으로 복구됩니다.</li>
</ol>5. 전극 배치의 조직학적 검증
<ol><li>실험이 끝나면 탄소 섬유 미세 전극을 사용하여 기록 현장에서 작은 병변을 생성합니다.<ol>
<li>전극을 실험 후 교정을 위해 보존해야하는 경우, 모세관 끝을 넘어 ~ 100 μm 돌출 유리 모세관에 배치 텅스텐 와이어를 사용합니다. 이 경우, 뇌에서 전극을 올리고, 기록 전극을 텅스텐 전극으로 대체하고, 동일한 등소벤트랄 좌표로 낮춥니까. 참고: 탄소 섬유는 뇌를 병변하는 데 사용될 수 있으며 기록 부위의 위치를 보다 정확하게 나타낼 수 있습니다. 그러나, 실험자는 이러한 전극을 보정하는 능력을 잃게됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레코딩 사이트를 병변하려면 전원 공급 장치를 사용하여 전압을 적용합니다. 1 V에서 시작하여 10V에 도달할 때까지 10초마다 1V씩 증가합니다.</li>
	<li>펜토바르비탈 (150 mg/kg)의 치명적인 복막 주사를 사용하여 동물을 안락사시킵니다.</li>
	<li>4% 포르말린 용액을 사용하여 쥐를 퍼퓨즈합니다.</li>
	<li>날카로운 기요틴을 사용하여 쥐에서 머리를 제거합니다.</li>
	<li>rongeurs를 사용 하 여, 뇌를 둘러싼 결합 조직과 두개골을 제거 하 고 부드럽게 나머지 조직에서 뇌를 제거.</li>
	<li>뇌를 1일 동안 4% 포르말린에 보관한 다음 30%의 자당으로 옮겨나세요. 참고 : 4 %의 포르말린을 가진 관류는 병변 부위를 볼 필요가 없지만 모범 사례로 병변 부위의 재건을 향상시킬 것입니다.</li>
	<li>저온을 사용하여 뇌의 30 μm 조각을 만듭니다.</li>
	<li>슬라이드에 슬라이스를 장착하고 커버 슬립으로 덮습니다.</li>
	<li>광 현미경을 사용하여 탄소 섬유 미세 전기 전하 병변 및 양극성 자극기 /주입 캐뉼라 위치의 위치를 나타냅니다.</li>
</ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gain+control+of+dopamine+delivery+in+freely+moving+animals.">Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals.</a> Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).</li><li>Keithley, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+sensitivity+dopamine+measurements+with+faster-scan+cyclic+voltammetry.">Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry.</a> Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).</li><li>Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-scan+cyclic+voltammetry+of+5-hydroxytryptamine.">Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine.</a> Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).</li><li>Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparison+of+norepinephrine+and+dopamine+release+in+rat+brain+by+simultaneous+measurements+with+fast-scan+cyclic+voltammetry.">In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).</li><li>Wenzel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+Dopamine+Signals+in+the+Nucleus+Accumbens+that+Cause+Active+Avoidance+Require+Endocannabinoid+Mobilization+in+the+Midbrain.">Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain.</a> Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).</li><li>Spanos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptor-Dependent+Cholinergic+Modulation+of+Mesolimbic+Dopamine+Cell+Bodies:+Neurochemical+and+Behavioral+Studies.">NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).</li><li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+enhance+subsecond+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats.">Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats.</a> Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).</li><li>Melchior, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+versus+electrical+stimulation+of+dopamine+terminals+in+the+nucleus+accumbens+reveals+local+modulation+of+presynaptic+release.">Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release.</a> Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies,+Fish,+and+Mice.">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li><li>Robinson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+rapid+chemical+communication+in+the+brain.">Monitoring rapid chemical communication in the brain.</a> Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+extracellular+dopamine+regulation+in+the+subregions+of+the+olfactory+tubercle.">Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).</li><li>Ganesana, M., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+transient+adenosine+during+cerebral+ischemia+and+reperfusion+injury.">Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury.</a> PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).</li></ol>

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CIS-FSCV는 Phasic DA 방출의 기본 VTA 수용체 메커니즘을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 적절한 레코딩을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 호출된 DA 신호에서 약간의 드리프트와 함께 안정적인 기준선 레코딩을 달성해야 합니다. 안정적인 레코딩을 구축할 가능성을 높이는 중요한 방법은 전극이 60Hz와 10Hz 모두에서 사이클링할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 하는 것?...

Phasic 도파민 (DA) 복부 tegmental 지역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens에 (NAc) 보상 관련 행동에 중요 한 역할을 한다. VTA DA 뉴런은 토닉형 발사(3-8Hz)에서 폭발형 발사(>14Hz)1로전환하여 NAc에서 면세 DA 방출을 생성합니다. VTA는 토닉에서 버스트 발사2,3,4,5로의전환을 조절할 수 있는 다양한 소마토덴드리틱수용체를 표현한다. 이러한 수용체중 어느 수용체와 그들의 각각의 입력을 식별, 제어 Phasic DA 릴리스보상 관련 회로가 조직되는 방법에 대한 우리의 이해를 심화합니다. 여기에 설명된 방법론의 목적은, 빠른 스캔 순환 볼탐법(CIS-FSCV)과 결합된 주입 및 자극을 결합하여, Phasic DA 방출을 구동하는 VTA 수용체의 기능을 빠르고 강력하게 평가하는 것이다.
결합된 주입 및 자극(CIS)이라는 용어는 뉴런(여기 VTA) 그룹에 약리적으로 수용체를 조작하고 수용체의 기능을 연구하기 위해 그 뉴런을 자극하는 것을 말합니다. 마취 된 쥐에서, 우리는 빠른 스캔 순환 Voltammetry (FSCV)에 의해 측정된 바와 같이, NAc 코어에서 큰 면세 DA 신호 (1-2 μM)를 연상시키기 위해 VTA를 전기적으로 자극한다. 자극 부위에서 약리학 약물(즉, 수용체 작용제/길항제)의 주입은 해조 된 Phasic DA 방출의 후속 변화를 관찰하여 VTA 수용체의 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다. FSCV는 높은 공간(50-100 μm)과 측두구(10Hz) 해상도를 모두 즐기는 전기화학적 접근법으로 보상 관련, 면책 DA 이벤트6,7을측정하는 데 적합합니다. 이 분해능은 마이크로투아분해와 같은 생체 내 신경화학적 측정보다 더 미세합니다. 따라서, 함께, CIS-FSCV는 Phasic 도파민 방출의 VTA 수용체 조절을 평가하기에 적합합니다.
VTA 수용체 기능을 조사하는 한 가지 일반적인 방법은 이러한 수용체가 뉴런1,8의발사 속도를 변경하는 방법을 해결하는 전기 생리학적 접근법의 조합을 사용하는 것입니다. 이러한 연구는 어떤 수용 체 활성화 시 DA 발사 운전에 관여 이해에 매우 귀중 하다. 그러나, 이러한 연구는 축 하 말기에서 하류 발생할 수 있습니다 제안할 수 있습니다 (즉, 신경 전달 물질의 방출). CIS-FSCV는 VTA 버스트 발사, 면질 DA 방출의 출력이 VTA 점선 및 세포 체에 위치한 수용체에 의해 어떻게 조절되는지에 응답함으로써 이러한 전기 생리학적 연구를 기반으로 합니다. 따라서 CIS-FSCV는 이러한 전기 생리학 연구에 기반을 두는 데 적합합니다. 예를 들어, 니코틴 수용체 활성화는 VTA9에서버스트 발사를 유도할 수 있고, 마취쥐에서 CIS-FSCV는 VTA에서 니코틴아세틸콜린 수용체(nAChR) 활성화가 또한 NAc10,11에서의 phasic DA방출을제어한다는 것을 보여주기 위해 사용되었다.
또한, Phasic DA 규정의 기계형 검사는 또한 일반적으로 약물의 목욕 응용 프로그램과 함께 슬라이스 준비를 사용하여 공부. 이러한 연구는 종종 세포 체가슬라이스12에서제거되기 때문에 도파민 말기에서 phasic DA 방출의 사전 시냅스 조절에 초점을 맞추고 있다. 이러한 준비는 도파민 터미널에 사전 시 냅 스 수용 체 효과 공부에 대 한 가치, CIS-FSCV 는 도파민 뉴런에 somatodendritic 수용 체 효과 연구에 더 적합 하는 반면, VTA에 사전 신냅스 입력 뿐만 아니라. 이러한 구별은 VTA에서 소마토덴디틱 수용체 활성화가 NAc 사전 시냅틱 수용체 활성화와 다른 효과를 가질 수 있기 때문에 중요합니다. 실제로, NAc에서 도파민제 전시냅틱 nAChRs를 차단하는 것은 버스트발사시 페이시브 도파민 방출을 상승시킬 수 있으며, 그 반대는 VTA 소마토덴드릭 nAChRs10,11에서사실이다.
CIS-FSCV는 Phasic DA 방출을 조절하는 VTA 수용체의 능력을 연구하기위한 이상적인 방법입니다. 중요한 것은, 이 접근은 마취또는 자유로운 이동중 하나인 그대로 쥐에서 수행될 수 있습니다. 이러한 접근법은 급성 연구에 적합하여, 그기준상태(10,14)에서 수용체 기능을 연구할 뿐만 아니라 약물 노출 또는 행동 조작 후 수용체의 기능적 변화를 평가할 수 있는 장기연구(11,15)에적합하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Electrode Filling Solution/Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF286-5 (28 gauge)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>236497-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fiber</td>
			<td>Thornel</td>
			<td>T650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller</td>
			<td>Narishige International</td>
			<td>PE-22</td>
			<td>Note: horizontal pullers can be used as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>626000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated wires for electrodes</td>
			<td>Weico Wire and Cable Incorporated</td>
			<td>UL 1423</td>
			<td>Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope (for viewing and cutting electrode)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin</td>
			<td>Phoenix Enterprises</td>
			<td>HWS1646</td>
			<td>To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putty</td>
			<td>Alcolin</td>
			<td><a target="_blank" href="https://www.dickblick.com/items/23922-1003/">23922-1003</a></td>
			<td>Used to place electrode on while cutting the carbon fiber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpal Blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500239</td>
			<td>For cutting carbon fiber to the apprpriate length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Wire</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>327026-4G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSCV Hardware/Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>U-Line</td>
			<td>H-3618 (36&#34; x 24&#34; x 42&#34;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potentiostat</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating electrode</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>MS303/2-A/SPC</td>
			<td>when ordering, request a 22 mm cut below pedestal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TarHeel HDCV Software</td>
			<td>University of North Carolina-Chapel Hill</td>
			<td>-</td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEI breakout box</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEI power supply</td>
			<td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> for ordering information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog stimulus isolator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS4</td>
			<td>Neurolog 800A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion/Stimulation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion Pump</td>
			<td>New Era Syringe Pump</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>C315I/SPC INTERNAL 33GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>PlasticsOne</td>
			<td>C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1776 P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>1770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>RT-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>29906-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Bone Anchor Screws/Pkg.of 100</td>
			<td>1.59 mm O.D., 3.2 mm long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire reference with AgCl</td>
			<td>InVivo Metric</td>
			<td>E255A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Gauze</td>
			<td>Vitality Medical</td>
			<td>441408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotax</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 902 (Dual Arm Bar)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BK Precision</td>
			<td>9110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>80497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten microelectrode</td>
			<td>MicroProbes</td>
			<td>WE30030.5A3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for infusions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-aspartate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scopolamine hydrobromide (S0929-1g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined infusion and stimulation with fast-scan cyclic voltammetry (cis-fscv) to assess ventral tegmental area receptor regulation of phasic dopamine

판면 도파민 (DA) 복부 테지멘트 영역에서 방출 (VTA) 핵 accumbens 보상 처리 및 강화 학습에 중추적 인 역할을한다. VTA 제어 면질 DA 방출에 다양한 뉴런 입력이 보상 처리 및 보강 학습을 제어하는 회로의 더 나은 그림을 제공 할 수있는 방법을 이해. 여기서는 생체내 고속 스캔 순환 볼탐법(FSCV)에서 측정한 약리학 작용제 및 길항제의 인트라-VTA 캐뉼라 주입을 자극-황량한 Phasic DA 방출(결합된 주입 및 자극 또는 CIS)과 결합하는 방법을 설명합니다. 마취된 쥐에서 CIS-FSCV를 사용하여, 핵 accumbens 코어에서 기록하는 동안 캐뉼라가 장착된 양극성 전극으로 VTA를 전기적으로 자극함으로써 면학적 DA 반응을 불러질 수 있다. 약리학 작용제 또는 길항제는 특정 VTA 수용체의 역할을 조사하기 위해 자극 부위에 직접 주입될 수 있다. CIS-FSCV의 주요 장점은 VTA 수용체 기능이 생체 내에서 연구될 수 있다는 것입니다.

CIS-FSCV는 NAc 코어에서 phasic DA 방출을 구동하는 VTA N-메틸-D-아스파르타테 수용체(NMDAR), 니코티닉 아세틸콜린 수용체(nAChRs), 무스카리닉 아세틸콜린 수용체(mAChRs)의 기능을 연구하는 데 사용되었다. 도 2는 음의 제어, 0.9% 식염수의 주입, 이전(기준선) 및 9분 후유혈(식염수)에 대한 대표적인 데이터를 나타낸다. 도 2는 y축, x축의 시...

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Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.

빠른 스캔 순환 볼탐법 (CIS-FSCV)과 결합 된 주입 및 자극을 결합하여 Phasic 도파민의 복부 테자멘트 영역 수용체 조절을 평가합니다.

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...

combined-infusion-stimulation-with-fast-scan-cyclic-voltammetry-cis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

3.0K 조회수.  Elizabethtown College. 이 프로토콜의 목표는 직접 서브 두 번째 도파민 방출에 자신의 기여를 연구하는 복부 tegmental 영역 수용체를 조작하는 것입니다.

비디오: Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

연구

신경과학

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

빠른 스캔 순환 Voltammetry와 Striatal 뇌 조각의 Presynaptic 도파민 역학

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, &amp; Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive procedures, and can be used to monitor electrode performance over the long term. EIS measures electrical impedance at multiple frequencies, and increases in impedance indicate increased glial scar formation around the device, while cyclic voltammetry measures the charge carrying capacity of the electrode, and indicates how charge is transferred at different voltage levels. As implanted electrodes age, EIS and CV data change, and electrode sites that previously recorded spiking neurons often exhibit significantly lower efficacy for neural recording. The application of a brief voltage pulse to implanted electrode arrays, known as rejuvenation, can bring back spiking activity on otherwise silent electrode sites for a period of time. Rejuvenation alters EIS and CV, and can be monitored by these complementary methods. Typically, EIS is measured daily as an indication of the tissue response at the electrode site. If spikes are absent in a channel that previously had spikes, then CV is used to determine the charge carrying capacity of the electrode site, and rejuvenation can be applied to improve the interface efficacy. CV and EIS are then repeated to check the changes at the electrode-tissue interface, and neural recordings are collected. The overall goal of rejuvenation is to extend the functional lifetime of implanted arrays.

The electrode-tissue interface of neural recording electrodes can be characterized with electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV). Application of voltage biasing changes the electrochemical properties of the electrode-tissue interface and can improve recording capability. Voltage biasing, EIS, CV, and neural recordings are complementary.

Electrical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) measure properties of the electrode-tissue interface without additional invasive ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Modeling Fast-scan Cyclic Voltammetry Data from Electrically Stimulated Dopamine Neurotransmission Data Using QNsim1.0

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is implicated in diseases and disorders including attention deficit hyperactivity disorder, Parkinson's disease, and traumatic brain injury. Thus, DA neurotransmission and the methods to study it are of intense scientific interest. In vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) is a method that allows for selectively monitoring DA concentration changes with fine temporal and spatial resolution. This technique is commonly used in conjunction with electrical stimulations of ascending DAergic pathways to control the impulse flow of dopamine neurotransmission. Although the stimulated DA neurotransmission paradigm can produce robust DA responses with clear morphologies, making them amenable for kinetic analysis, there is still much debate on how to interpret the responses in terms of their DA release and clearance components. To address this concern, a quantitative neurobiological (QN) framework of stimulated DA neurotransmission was recently developed to realistically model the dynamics of DA release and reuptake over the course of a stimulated DA response. The foundations of this model are based on experimental data from stimulated DA neurotransmission and on principles of neurotransmission adopted from various lines of research. The QN model implements 12 parameters related to stimulated DA release and reuptake dynamics to model DA responses. This work describes how to simulate DA responses using QNsim1.0 and also details principles that have been implemented to systematically discern alterations in the stimulated dopamine release and reuptake dynamics.

Fast-scan cyclic voltammetry can monitor in vivo dopamine neurotransmission in the context of drugs, disease, and other experimental manipulations. This work describes the implementation of QNsim1.0, a software to model electrically stimulated dopamine responses according to the quantitative neurobiological model to quantify estimates of dopamine release and reuptake dynamics.

QNsim1.0을 이용한 전기 자극 도파민 신경 전달 데이터의 고속 스캔 순환 전압 측정 데이터 모델링

Central dopaminergic (DAergic) pathways have an important role in a wide range of functions, such as attention, motivation, and movement. Dopamine (DA) is ...