Die biomedizinische Forschung steht vor einer Reproduzierbarkeitskrise, da neue Forschungsergebnisse selten in therapeutische Anwendungen umgesetzt werden. Dieses Protokoll reduziert den menschlichen Faktor und führt Automatisierung und Standardisierung in die Fertigung ein. Diese Methode konzentriert sich speziell auf photovernetzbare Hydrogele für 3D-Zellkulturanwendungen, da Hydrogele in den letzten zehn Jahren zur am häufigsten verwendeten Plattform in Krebs- und anderen Krankheitsgewebemodellen geworden sind.
Mit der Entwicklung einer Open-Source-Technologieplattform haben wir die aktuellen Hard- und Software-Einschränkungen erfolgreich adressiert. Diese Plattform wurde speziell für Hydrogele entwickelt und ermöglicht automatisierte Fertigungsabläufe für die Tissue-Engineering-Forschung. Um die API zu installieren, öffnen Sie die Befehlszeilenschnittstelle.
Um die Arbeits-API zu installieren, geben Sie pip install openworkstation ein und drücken Sie die Eingabetaste. Um das Pipettier-Biofabrikationsmodul zu betreiben, geben Sie den Befehl zur Installation der opentrons-API ein. Öffnen Sie dann über die Befehlszeile ein Python-Skript und überprüfen Sie, ob beide APIs erfolgreich installiert wurden.
Um den Protokollcode zu generieren, öffnen Sie die Protokollentwurfsanwendung, um ein benutzerdefiniertes Protokollskript zu generieren, das von der Plattform ausgeführt wird. Die Schnittstelle läuft auf jedem gängigen Internetbrowser. Geben Sie den Protokollnamen auf der Setup-Seite ein und klicken Sie auf Weiter.
Wählen Sie in der Einrichtung des Eingabefachs drei mal vier Heizblöcke aus, um das Einzugsfach zu definieren. Um die Materialien und Stammkonzentrationen zu definieren, wählen Sie Gel 1 aus dem Menü Eingaben definieren und geben Sie GelMA als Namen ein. Legen Sie die Stammkonzentration auf 20 % und die Anzahl der Proben auf drei fest und klicken Sie auf Hinzufügen, um die Einträge zu speichern und die erste Spalte zu füllen.
Wählen Sie Gel 2 aus dem Menü Eingaben definieren und geben Sie Alginat als Namen ein. Legen Sie die Stammkonzentration auf 4 % und die Anzahl der Proben auf drei fest und klicken Sie auf Hinzufügen, um die Einträge zu speichern und die zweite Spalte zu füllen. Nachdem Sie den Photoinitiator und die Verdünnungsmittelparameter wie gezeigt eingestellt haben, wählen Sie die Fotovernetzung, stellen Sie die Zeit auf 30 Sekunden und die Intensität auf zwei und klicken Sie auf OK. Legen Sie als Nächstes den Wellplattentyp auf 96 Well Plate fest und klicken Sie auf Gruppe 1, um die Parameter für die Erstellung von Doppelnetzwerk-Hydrogelen anzugeben.
Aktivieren Sie dann bei Bedarf das Kontrollkästchen Erweitertes Mischprotokoll anwenden, legen Sie die Anzahl der Samples auf 96 fest und klicken Sie auf Weiter. Um das Deck-Layout festzulegen, wählen Sie den entsprechenden Tray-Typ für jeden Slot aus. Wenn alle Tray-Typen ausgewählt wurden, klicken Sie auf das linke Pipettenfeld und wählen Sie 10 bis 100 Mikroliter Verdrängung aus dem Dropdown-Menü.
Stellen Sie die Sauggeschwindigkeit auf 600 und die Dosiergeschwindigkeit auf 800 ein. Stellen Sie dann die Pipettenparameter auf die gleiche Weise richtig ein. Klicken Sie dann auf Protokoll generieren, um das Protokollskript zu generieren und zu speichern.
Bevor Sie das Protokoll ausführen, besprühen Sie die Verbrauchsmaterialien mit 70% Ethanol und positionieren Sie sie entsprechend dem im Benutzer-Setup definierten Setup. Platzieren Sie die Reaktionsrohre mit den Materialien im Aluminiumblock auf den Temperaturdocks entsprechend dem gewählten Setup. Als nächstes besprühen Sie Ihre Handschuhe mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Reaktionsröhrchen vorsichtig, ohne die geöffneten Röhrchen zu berühren.
Wenn die Substanzen die entsprechende experimentelle Temperatur erreicht haben, führen Sie das generierte Protokoll über die Benutzeroberfläche aus. Die Workstation beginnt mit dem Homing-Prozess, gefolgt von einer leeren Well-Platte aus dem Speichermodul. Nach dem Entfernen des Deckels von der Brunnenplatte wird die Platte zum nächsten Modul transportiert.
Das Protokoll legt das Volumen fest, das aus jeder Stammlösung pipettiert wird, und ändert automatisch die Spitzen nach jedem Material, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Um viskose Lösungen reproduzierbar zu mischen, führt die Workstation ein spezifisches Mischprotokoll aus, das für viskose Hydrogele optimiert wurde. Die Protokolldesign-App berücksichtigt den Füllstand des Behälters und passt die Mischhöhe automatisch an, um unnötiges Eintauchen in die viskosen Materialien zu vermeiden.
Nach automatischer Generierung von 3D-Modellen und Brunnenplatten schließt der Arbeitsplatz die Brunnenplatte wieder mit dem Deckel und speichert die Brunnenplatte in der programmierten Position im Speichermodul. Sobald das Protokoll abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus dem Speichermodul. Zur Validierung und Verifizierung des leitungsgeführten Protokolls laden Sie die Platte auf ein Spektralphotometer und lesen Sie die Absorption zweimal bei 450 Nanometern ab.
Öffnen Sie nach dem Speichern der Absorptionswerte die Analysetabellendatei, die als ergänzendes Material in der Publikation bereitgestellt wird, und kopieren Sie die Absorptionswerte in die Tabelle im Rohdatenblatt. Klicken Sie dann auf das Analyseblatt, um die Mittelwerte, die Standardabweichung und den Varianzkoeffizienten anzuzeigen, die automatisch berechnet und angezeigt werden, um eine gleichmäßige Stichprobenverteilung für bestimmte Zeilen und für bestimmte Spalten einer 96-Well-Platte zu erhalten. Um den Aufbau zu finden, der eine hohe Reproduzierbarkeit für Glycerinlösungen gewährleistet, wurden Protokolle ohne Temperaturregelung und ohne Spitzenberührung, mit Temperaturregelung und ohne Spitzenberührung oder mit Temperaturregelung und mit Spitzenberührung erstellt.
Der berechnete Variationskoeffizient für die drei Setups zeigte einen signifikanten Einfluss des Temperaturdocks und der Tip-Touch-Funktion, was die Fähigkeit des Protokolls unterstreicht, bei Verwendung beider Funktionen hochgradig reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Durch die Tip-Touch-Funktion mit dem Temperatur-Dock wurde die Standardabweichung in Setup drei deutlich reduziert. Das Aufzeichnen der Probenabsorptionswerte für Setup drei ergab während des gesamten Experiments keine steigenden oder abnehmenden Werte und zeigte daher keinen Einfluss der Probenposition auf die Absorptionswerte.
Als nächstes wurde eine GelMA-Verdünnungsserie hergestellt, indem eine 20% ige GelMA-Stammlösung verdünnt und die Unterschiede zwischen verschiedenen GelMA-Verdünnungen bewertet wurden. Der bei jedem Konzentrationsschritt gemessene Absorptionswert war signifikant unterschiedlich und die lineare Regression zeigte eine hohe Anpassung, die die Fähigkeit zur Erzeugung unterschiedlicher Konzentrationsschritte bestätigte. Zusätzlich wurde der Einfluss des Tip Touch für Doppelnetzwerk-Hydrogele mit 5%GelMA, 2%Alginat und 0,15%LAP bewertet, die mit dem Setup automatisch generiert wurden.
Die Integration des Tip Touch führt zu einer signifikanten Verringerung der Standardabweichung, was die Generierung eines reproduzierbaren Datensatzes unterstützt. Die Visualisierung der Absorptionswerte und Heatmaps bestätigte die reduzierte Abweichung bei der Verwendung von Tip Touch, um überschüssiges Material aus der Spitze zu entfernen. Unsere Technologie ermöglicht die Automatisierung der Hydrogelherstellung für 3D-Zellkulturen und Tissue Engineering.
Es ist eine kostengünstige Lösung, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit technisch anspruchsvoller Arbeitsabläufe zu erhöhen. Durch die Bereitstellung eines anpassbaren Open-Source-Ansatzes ebnet diese Technologie den Weg für die weit verbreitete Anpassung der Prozessautomatisierung in der Tissue-Engineering-Forschung.
