Die Autoren möchten sich unsere Finanzierungsquelle NSERC 20/20 Netzwerk für die Entwicklung von Advanced Ophthalmic Materials zu bestätigen.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien skizziert von der University of Waterloo Tierforschungsethikkommission abgeschlossen. Die Rinderaugen sind großzügig von einem örtlichen Schlachthof gespendet. 1. Augen Modell <ol><li> Konstruktion und Herstellung von Formen 13 <ol><li> Entwerfen Sie die Augenmodelle entsprechend den durchschnittlichen physiologischen Dimensionen des menschlichen erwachsenen Augen. 13 </li><li> Lassen Sie einen Abstand von 250 &amp; mgr; m zwischen dem Augapfel und dem Augenlid Stücke des Augenmodells. Entwerfen Sie die jeweiligen Formen unter Verwendung von Computer-Aided Design (CAD) Software. </li><li> Erstellen Sie neue .cad Datei oder .sldprt Datei mit AutoCAD oder Solidworks. Erstellen von 3D-Modellen des menschlichen Augapfel / Augenlid. Erstellen Formen der Modelle und die Formen als .stl-Dateien speichern. </li><li> Import STL - Dateien in 3D - Druckersoftware (zB makeware für replicator2). Geben Sie Parameter des Druck (Standort, Kargheit, Maßstab, Orientierung, Glätte usw. </em&gt;) 13. </li><li> Speichern Sie die Datei als G-Code-Datei für 3D-Drucker zu lesen. Wählen Materialien wie PLA (Polymilchsäure), ABS (Acrylnitril - Butadien - Styrol), PC (Polycarbonat), oder einer Kombination davon, zu drucken , um die Formen 13. </li><li> Installieren gewünschten Filaments von dem Material der Wahl. Importieren Sie die G-Code-Datei in den 3D-Drucker zu lesen. Drucken Sie die Form. HINWEIS: Alternativ erzeugen die Augenformen einen Computer numerisch (CNC) Maschine, wenn eine glattere Oberfläche auf dem Augenmodell gewünscht wird gesteuert. Für CNC Formenbau, Materialien für die Formen werden nicht mehr nur auf thermische Kunststoffe, aber auf Metall, Keramik und chemisch resistive Polymere wie Polytetrafluorethylen erstrecken. </li><li> Öffnen Sie die CNC-Software-Schnittstelle, die mit einem Schneidbohrer verbunden ist. Konstruieren Sie 3D-Formen nach vorne, oben, Seiten- und perspektivische Ansichten der zuvor konstruierten Augapfel / Augenlid Modell Formen in Steuerungs-Software-Schnittstelle. Wählen Sie den entsprechenden Parameter für dieBearbeitung (Bitgröße, Substratmaterial, Materialstärke) und fahren Sie mit der Form zu schneiden. </li></ol></li><li> Synthese von Okulare PDMS <ol><li> Unter Verwendung einer Spritze, messen 10 ml Volumen von PDMS (Polydimethylsiloxan) Basis und füllen Sie ihn in eine 15-50 ml Zentrifugenröhrchen. Werden 10% w / v der Elastomerlösung des Gesamtgewichts des PDMS. Mit einem Rührstab, mischen Sie die gut-Lösungen. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Lösung in den Augapfel und Augenlid Formen. Lassen Sie die PDMS bei RT O / N (oder mindestens 12 hr) zu regeln, die Polymerisation zu starten und zu ermöglichen, Blasen aus dem Polymer zu lösen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen in der PDMS-links, die möglicherweise steigen oder zu erweitern. </li><li> Anschließend stellen die Formen in eine 75 ° C (167 ° F) heißen Ofen für 1 Stunde oder 150 ° C (302 ° F) für 5 min. Für ein weicheres Gel, lassen Sie die PDMS bei RT sitzen für mindestens 48 Stunden, um vollständig zu polymerisieren. </li><li> Lege die Proben in einer Gefriertruhe für einige min; dies wird die PDMS schrumpfen und zu vereinfachen,die Entnahme der Proben aus den Formen. Extrahieren Sie die Okulare aus den Formen einer dünnen Spachtel. </li><li> Für die Lieferung der Lösung in den Raum zwischen dem Augapfel und Augenlid Stücke, schließen Sie einen 1/16 &quot;x 1/8&quot; Polytetrafluorethylen Rohr mit einem 1/16 &quot;gleich Bein Koppler Rohrverbinder und befestigen Sie es auf das Augenlid Stück am Rohrloch . </li></ol></li><li> Synthese von Eyeball Stückes Agarose HINWEIS: Der Augapfel Stück synthetisiert werden können andere Polymere verwendet, wie Agarose. Das folgende Verfahren kann auch Augenstücke aus einer Vielzahl von Agar-Typen, wie PDA (Kartoffel-Dextrose-Agar) oder SDA (Sabouraud-Dextrose-Agar) zu erzeugen, modifizieren. <ol><li> Um eine 2% (2 g / 100 ml) Gel, messen 2 g Agarose produzieren und mit 100 ml Reinstwasser mischen. Bringen Sie die Lösung zum Kochen bringen (100 ° C), so dass die Agarose vollständig auflöst. Lassen Sie die Lösung abkühlen 5 min nach unten. </li><li> Füllen Sie die Lösung in den Augapfel Form und lassen Sie die Lösung für 3 zu kühlen0 min bei RT. Entfernen Sie die Augapfel Stücke mit einem Spatel. Lagern Sie den Augapfel Agar in einem -20 ° C Gefrierschrank für die spätere Verwendung. Für die Mikrobiologie Studien, Sterilisieren der Augapfel Formen im Autoklaven und / oder UV-Bestrahlung. </li></ol></li><li> Der Einbau von Bovine Cornea auf PDMS Eyeball HINWEIS:. Dieses Protokoll von Parekh angepasst wurde , et al 14 <ol><li> Führen Sie die Präparation und Einbau der Rinder-Cornea unter sterilen Bedingungen unter einer Laminar-Flow-Haube. Erwerben die Augen und sezieren sie am selben Tag. </li><li> Drehen Sie den Flow-Haube auf 10 Minuten vor der Verwendung und sanieren mit 70% Ethanol Alkohol. Sicherzustellen, dass alle Materialien und Instrumente steril sind durch Autoklavieren bei 273 ° F / 133 ° C für 45 min, und positioniert ist nicht weniger als 4 Zoll von der Strömungshaube Eingang. </li><li> Tauchen Sie die Rinderauges in einen Becher mit einem verdünnten PVP-Jod-Lösung für 2 min enthält. Spülen Sie das Auge in ein Becherglas mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7.4. Mit einer Pinzette vorsichtig aufstreichen Auge auf eine Petrischale aus Glas, Hornhautseite nach oben. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Muskel und Fettgewebe durch an den scleral Befestigungspunkte mit stumpfen Ende Dissektion Schere schneiden. Entsorgen Sie das überschüssige Gewebe in einen sterilen Becher für tierische Abfälle bezeichnet. </li><li> Mit Mikro-Schere, entfernen Sie die Bindehaut aus dem Auge. Wickeln Sie das Auge mit steriler Gaze, einen Abstand von mindestens 1 cm vom Limbus zu halten. </li><li> Mit einem Skalpell einzuschneiden die Sklera etwa 2 mm vom Limbus Region und oberflächlich, um Durchdringung des darunterliegenden Choroidea und Glaskörper zu vermeiden. verlängern Sie vorsichtig den Schnitt um 360 ° mit einem Skalpell oder Dissektion Schere ohne die Hornhaut aus ihrer natürlichen Krümmung zu verformen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Hornhaut aus dem Auge. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie anhaftenden Uvea Gewebe und spülen Hornhaut mit PBS. </li><li> Lagern Sie die Hornhaut bei 31ºC in einem sterilen Behälter mit KulturMedium (wie beispielsweise Medium 199) 3% Fetal Bovine Serum enthaltendem Gewebe Feuchtigkeit und Zell Nahrung aufrechtzuerhalten. </li><li> Vor dem Experimentieren, ruhen die ausgeschnittenen Hornhaut auf dem PDMS Augapfel, und klemmen Sie die beiden Stücke zusammen mit einem spezialisierten Clip-on. </li></ol></li></ol> 2. Blink-Plattform <ol><li> Design und Produktion der Blink-Plattform HINWEIS: Die Blink-Plattform besteht aus drei Funktionsteilen: Augenmodell (beschrieben in Abschnitt 1), Getriebe und Elektronik. <ol><li> Gestaltung und Herstellung der blink-Plattform CAD und 3D-Druck, ähnlich wie für das Auge Modell beschrieben (Abschnitt 1.1). Gestalten Sie das Getriebe , so dass es eine einfache Drehung der Motoren in die seitlichen und Drehbewegungen der Okulare übersetzt. 15 </li><li> Verwendung des Ritzels und Getriebemechanismus, zu übersetzen Drehbewegung eines Schrittmotors in die seitliche Bewegung eines Ritzels, die mit den Augenlid Stücken verbunden ist. </li><li> Verwendung derKonjugat Getriebesystem, von einem Schrittmotor in drei (oder mehr) Drehbewegungen für drei verschiedene Augapfel Stücke eine Drehbewegung zu verstärken. </li><li> Ausrichten der zwei Getriebesysteme, eine für das Augenlid und einen für Augapfels, so dass der Abstand zwischen den beiden konstant sind. Bauen Sie die Elektronik mit einem Mikrocontroller, Motorschild und zwei Motoren. HINWEIS: zwei Schrittmotoren Rotationsmotoren zu schaffen, die durch das Getriebesystem in eine blinkende Bewegung übersetzt wird. </li><li> Verbinden die beiden Schrittmotoren mit einem System, bestehend aus einem Motorschild auf dem Mikrocontroller gestapelt. Schließen Sie und konfigurieren Sie die elektronischen Komponenten mit Open-Source-Software-Produkten zu arbeiten. </li><li> Programmieren Sie das System auf Motorparameter steuern, wie Umdrehungen pro Minute (RPM), die Anzahl der Runden nach vorne, die Anzahl der Runden zurück und drehen Stil. HINWEIS: Siehe die zusätzliche &quot;Arduino-Code-Datei&quot; für weitere Einzelheiten. </li><li> Laden Sie die Systemsoftware von der masteller &#39;Website. </li><li> Installieren Sie die Software und öffnen. Schreiben Sie den Code zu Schrittmotoren in der gewünschten Konfiguration zu steuern. Verbinden des Systems mit einer Quelle des elektronischen Systems mit Energie zu versorgen, so dass die Motoren in der gewünschten Weise bewegen, wie durch den Forscher definiert. HINWEIS: Siehe die zusätzliche &quot;Arduino-Code-Datei&quot;. </li></ol></li><li> Montage mit Mikrofluidik (künstliche Tränenlösung) <ol><li> Nehmen Sie die synthetisierten Augapfel und Augenlid Stücke und rutschen sie auf den entsprechenden Clip-ons für das Auge-Modell. Den Schlauch, der mit einer Spritze und positioniert auf der mikrofluidischen Pumpe mit dem Augenlid Stück (Abschnitt 1.2.5) verbunden ist. Testen Sie die Plattform laufen und für eine konsistente Bewegung überprüfen. </li><li> Prime der Schlauch und überprüfen für einen steten Fluss von künstlichen Tränenlösung (ATS). Das Rezept für ATS wurde bereits berichtet. 16 </li><li> Manuell bewegen zusammen, um die Augenmodellteile auf einer ebenen Fläche, so dass der Augapfel und das AugeDeckel in Kontakt sind. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des mikrofluidischen Pumpe auf gewünschte Werte. Stellen physiologischen Flussraten von 1 bis 1,5 &amp; mgr; l / min. 17 </li><li> Die Pumpe und die Aktoren Experiment zu beginnen. Für die Lieferung Experimente Medikament, legen Sie die arzneimittelhaltige Kontaktlinse auf dem Augapfel Stück. </li><li> Ermöglichen die Durchflussflüssigkeit in eine 12-Well-Platte zu tropfen. Bei den festgelegten Zeitintervallen gewünscht, zu quantifizieren , den Analyten oder Arzneimittelkonzentration unter Verwendung üblicher Nachweisverfahren wie UV-Vis - Spektroskopie oder Fluoreszenz. 1,4,18 </li><li> Für Studien Ablagerung von Tränenkomponenten auf Kontaktlinsen Auswertung, legen Sie die Kontaktlinse auf dem &quot;Augapfel&quot; Stück. Sammeln Sie die Durchströmungsflüssigkeit, die verworfen werden kann. </li><li> Nach der gewünschten Zeitintervallen, entfernen Sie die Kontaktlinse aus dem Augapfel Stück und bereiten die Linse für eine weitere Analyse, wie die konfokale Mikroskopie. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt drei wichtige Schritte innerhalb des Protokolls, die besondere Aufmerksamkeit erfordern: Design und Herstellung von Formen (Abschnitt 1.1), Plattformeinheit (Abschnitt 2.2.1-2.2.3) und die Überwachung der Versuchslauf (Abschnitt 2.2.4-2.2.7 ). In Bezug auf die Konstruktion und Herstellung von Formen (Abschnitt 1.1), sollte der Augapfel Stück nach den Abmessungen einer menschlichen Hornhaut ausgebildet sein. Allerdings kann es mehrere Prototypen der Form vor einem Augapfel Stück benötigen, können erstellt we...

Zwei wesentliche Bereiche von Interesse innerhalb der Kontaktlinse (CL) Arena sind Unbehagen und die Entwicklung neuer CL-Anwendungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen CL Beschwerden Aufklären ist ein Thema, das Feld für Jahrzehnte. 8 Die Entwicklung neuer, funktionaler CLs, wie Drug-Delivery - Geräte 1,3,9 und Biosensoren ausgewichen hat, 10-12 ein Bereich von wachsendem Interesse ist, mit erheblichen potenziellen Märkten. In beiden Fällen würde ein hoch entwickeltes In - vitro - Modell relevanten Informationen zur Verfügung mit der Auswahl geeigneter Linsenmaterialien oder Konstruktionsmerkmale , während der Entwicklungsphase zu unterstützen. Leider sind aktuelle In - vitro - Modelle für CLs und andere Augenbezogenen Anwendungen Auswertung relativ grob und ungekünstelt. Traditionell Studien CL in vitro Auswertung Tränenfilmabscheidung oder Arzneimittelabgabe werden in statischen, große Volumen Fläschchen durchgeführt ein festes Flüssigkeitsvolumen enthält, die greatly übersteigt physiologischen Mengen. Außerdem fehlt diesem einfachen Modell der natürlichen Tränenströmungskomponente und den Blinkreflex, welche beide Faktoren der Augenumgebung definieren. Die Entwicklung eines anspruchsvollen, physiologisch relevanten Auge &quot;Modell&quot; wird einen multidisziplinären Ansatz erfordern und erfordern erhebliche In - vivo - Validierung. Aus diesen Gründen ist der grundlegende Rahmen für unsere in - vitro - Augenmodell sehr vielseitig, so dass das Modell kontinuierlich durch zukünftige Upgrades und Modulationen verbessert werden. Bis heute ist das Modell der Simulation Tränenvolumen der Lage, Tränenfluss, mechanischer Verschleiß und Luft ausgesetzt. Das Ziel ist es, ein in - vitro - Modell zu erstellen, um aussagekräftige Ergebnisse liefern wird, die in vivo prädiktive und kostenlose und Ex - vivo - Beobachtungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)</td>
			<td style="width:125px;">Adafruit</td>
			<td style="width:451px;">50</td>
			<td style="width:273px;">Board</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stepper motor</td>
			<td style="width:125px;">Adafruit</td>
			<td style="width:451px;">324</td>
			<td>Motor and Motor shield</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16&#34;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:451px;">CA11009-280</td>
			<td>50 pcs of tube connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Tubing PT/SIL 1/16&#34;x1/8&#34;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:451px;">16211-316</td>
			<td>Case of 50feet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">PDMS</td>
			<td style="width:125px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:451px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Agarose, Type 1-A, low EEO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:451px;">A0169-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">PHD UltraTM</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:451px;">703006</td>
			<td>MicroFluidic Pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Bovine cornea</td>
			<td style="width:125px;">Cargill, Guelph/ON</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Soldidworks</td>
			<td style="width:125px;">Dassault Systemes</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:281px;">3-D printing</td>
			<td style="width:125px;">University of Waterloo - 3D Print Centre</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:281px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td>General dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Medium 199</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td>Culture medium storage for cornea</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:451px;"></td>
			<td>Add to culture medium, 3% total volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro ocular platform to test contact lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Die synthetisierten Augenformen aus der Werkstatt erhalten und von 3-D - Druck sind in Abbildung 1 dargestellt. Diese Formen können mit einer Vielfalt von Polymeren, wie PDMS und Agarose, verwendet werden Okulare mit den gewünschten Eigenschaften herzustellen. Das bedeutete Montage des Augenmodells Plattform mit einer Mikrofluidik - Spritzenpumpe ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Plattform simuliert mechanischen Verschleiß über die Drehung des Auga...

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Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Aktuelle In - vitro - Modelle zur Bewertung von Kontaktlinsen (CLS) und andere Augenbezogene Anwendungen sind stark eingeschränkt. Die dargestellte Augen Plattform simuliert physiologische Tränenfluss, Tränenvolumen, Lufteinflüssen und mechanischer Verschleiß. Dieses System ist sehr vielseitig und kann auf verschiedene in vitro mit CLs Analysen angewendet werden.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

10.5K Aufrufe.  University of Waterloo.  Aktuelle In - vitro - Modelle zur Bewertung von Kontaktlinsen (CLS) und andere Augenbezogene Anwendungen sind stark eingeschränkt. Die dargestellte Augen Plattform simuliert physiologische Tränenfluss, Tränenvolumen, Lufteinflüssen und mechanischer Verschleiß. Dieses System ist sehr vielseitig und kann auf verschiedene in vitro mit CLs Analysen angewendet werden. 

Serie: Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Forschung

Biotechnik

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Emaille Nachwachsen mit einem dichten Schnittstelle

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex

Medical devices implanted in the brain hold tremendous potential. As part of a Brain Machine Interface (BMI) system, intracortical microelectrodes demonstrate the ability to record action potentials from individual or small groups of neurons. Such recorded signals have successfully been used to allow patients to interface with or control&#160;computers, robotic limbs, and their own limbs. However, previous animal studies have shown that a microelectrode implantation in the brain not only damages the surrounding tissue but can also result in functional deficits. Here, we discuss a series of behavioral tests to quantify potential motor impairments following the implantation of intracortical microelectrodes into the motor cortex of a rat. The methods for open field grid, ladder crossing, and grip strength testing provide valuable information regarding the potential complications resulting from a microelectrode implantation. The results of the behavioral testing are correlated with endpoint histology, providing additional information on the pathological outcomes and impacts of this procedure on the adjacent tissue.

We have shown that a microelectrode implantation in the motor cortex of rats causes immediate and lasting motor deficits. The methods proposed herein outline a microelectrode implantation surgery and three rodent behavioral tasks to elucidate potential changes in the fine or gross motor function due to implantation-caused damage to the motor cortex.

Nagetier Verhaltens Tests, um funktionelle Defizite verursacht durch Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex Ratte bewerten

Medical devices implanted in the brain hold tremendous potential. As part of a Brain Machine Interface (BMI) system, intracortical microelectrodes ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Entwicklung eines

Zusammenfassung

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Tissue Engineering eines Menschen 3D

Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für