Diese Arbeit wurde von der Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Ausbildung Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 und NIH K01AR069116 unterstützt. Die Autoren möchten sich Patrick Wong für seine Beiträge in der Datenerhebung danken.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Washington University in St. Louis Tierstudien Ausschuss durchgeführt. 1. Tiere <ol><li> Erhalten Sie zwei Stämme von Mäusen: 10 Wochen alte Balb / c (n = 6, Balb-M, BALB / cAnNTac) und 10 Wochen alte nuclear factor kappa-B-Luciferase-Reporter Tiere (NF-κβ-luc) gezüchtet auf einem BALB / c-Hintergrund (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen). </li><li> Vor der Dissektion euthanize Tiere mit CO 2 Überdosierung bei einer Flußrate von 2,5-3 l / min für 5 min , gefolgt von weiteren 2 min Zeit der Behausung. </li><li> Desinfizieren des Außenbereiches des Tieres, indem sie in einem 70% Ethanol-Bad für 2 min vor der Dissektion Baden. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Führte einen Längsvertikalschnitt auf der dorsalen Oberfläche der Maus kleine Dissektion Schere mit der Körperhöhle zu exponieren. </li><li> Machen Sie zwei vertikale Längsschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule des Tieres abder erste Lendenwirbel (L1) an die Schwanzwirbel (C8). </li><li> Unter Verwendung eines Skalpells, feinen Pinzette und Schere fein Dissektion vorsichtig entfernen die Wirbelsäule von L1-C8 aus der Körperhöhle des Tiers. </li><li> vorsichtig entfernen überschüssige Weichgewebe die Wirbelsäule umgeben, während sichergestellt wird, um nicht abkratzen oder IVD auf der ventralen Seite verletzen. </li><li> die Wirbelsäule in die Wirbelkörper-scheiben Wirbel funktionelle Wirbelsäuleneinheiten (FSU) in der L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 und C7 / C8 Scheiben weiter sezieren. </li><li> Spülen Sie die FSU in Hanks balancierter Salzlösung, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin für 2 min. </li><li> zuweisen zufalls die FSU in drei Gruppen: uncultured und unbehandeltem FSUs (frisch), gezüchteten aber unbehandelten FSUs (Kontrolle) kultiviert und behandelt FSUs stab (STAB). </li><li> Schnellfrost die frischen FSU Proben mit flüssigem Stickstoff unmittelbar nach Dissektion und Speicher in einem -20 ° C-Gefrierschrank. </li></ol> 3. Organkulturbedingungen<ol><li> Bereiten 500 ml steriles Kulturmedium von 1: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml serologischen Pipetten, Pipetten 2 ml Kulturmediums in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Folgende Dissektion und spülen, stellen jeweils FSU in eine einzelne Vertiefung in den Medien gefüllten 24-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Proben in einem sterilen Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und&gt; 90% Luftfeuchtigkeit bewahrt. </li><li> Nach einer anfänglichen Kulturdauer von 24 h, verletzen mechanisch STAB Gruppenproben über Nadeleinstich des Anulus fibrosus eine sterile 27-Gauge - Nadel , wie in 1A gezeigt. </li><li> Ändern Medien alle 48 h durch eine neue Medien gefüllte Vorbereitung 24-Well-Kulturplatte und Transfer Proben von der alten Platte auf die neue mit einem sterilen Pinzette. Aspirieren die alten Medien und dispose der alten Kulturplatte in einem Biohazard Abfalleimer. </li><li> Am letzten Tag der Kultur, Inkubieren alle Proben in Medium 0,75 mg / ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid für 24 h enthalten. </li><li> Danach gefriert ganzen FSUs mit flüssigem Stickstoff und Speicher in einem -20 ° C - Gefrierschrank , bis sie bereit für die mechanische Prüfung oder Histologie (1B). </li></ol> 4. Längs Messungen NF-kappaB <ol><li> Bild die FSU von NF-κβ-Luciferase Tieren bei 1, 5, 13 und 19 Tagen NF-kappaB Ausdruck zu bewerten. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von 1 mg / ml Luciferin-Lösung in jeder Vertiefung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Bild, um die Proben für die Biolumineszenz unter Verwendung des Abbildungssystems mit einer 1 min Belichtungszeit und bin Einstellung von 2. </li><li> Gleichzeitig verwendet die Maschine um ein Bild aufzunehmen und es mit dem Biolumineszenz-Bild überlagert die anatomische Lage der Lumineszenz in der IVD zu bestimmen. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. mechanische Beurteilung <ol><li> Bestimme das mechanische Verhalten der IVDs durch Verwendung Wegkontrolliert dynamische Kompression 9. </li><li> Unter Verwendung einen Dissektionsmikroskop, Skalpell und Pinzette, entfernt die knöchernen Wirbelkörper der FSU von jeder Probe, während der knorpeligen Endplatten intakt zu halten und den IVD befestigt. </li><li> Befestigen der isolierten IVDs auf eine 1 cm x 1 cm x 0,2 cm Aluminiumplatte unter Verwendung von Cyanacrylat-Klebstoff. </li><li> Messen Sie die Scheibenhöhe und Breite um durchschnittlich drei Messungen auf der Längsachse jeder Scheibe unter einem Laser-Mikrometer verwendet wird. Berechnen Sie das Scheibenhöhenverhältnis, indem die durchschnittliche Scheibenhöhe durch die maximale Scheibenbreite dividiert wird. </li><li> Verwenden der gemessenen Scheibenhöhe der Eingangsspannungswerte in mechanischen Tests verwendet zu berechnen. Beachten Sie, dass die durchschnittliche Scheibenhöhe um ± 39 um etwa 690 war. </li><li> Platzieren Sie die Proben in einer phosphatgepufferten Salzbades unter der compressiauf Maschine und Vorspannung der Scheibe bis 0,02 N. </li><li> Zyklisch komprimiert die Scheibe mit einer sinusförmigen Wellenform bei 1 Hz für 20 Zyklen bei der 1% Dehnung Ebene und 5% Dehnungsniveau für jede 3-Studien unter Verwendung von und die Last und die Verschiebungswerten der IVD aufzuzuzeichnen. Erlauben Sie 10 Minuten Zeit zwischen den Versuchen für die Scheibe ruht sich zu entspannen und um Verletzungen zu vermeiden. </li><li> Berechne die mittlere Steifigkeit von der Ladephase des letzten Zyklus, und berechnet die Verlusttangente von dem Phasenwinkel zwischen Last- und Verschiebungsdaten. </li></ol> 6. Proteoglycan und Kollagen Quantifizierung <ol><li> Nach der mechanischen Tests messen die Scheibe Naßgewicht durch das isolierte IVD in einer vorher tariertes Zentrifugenröhrchen platziert und Messen des Gewichts einer Analysenwaage verwendet wird. </li><li> Verdauen des isolierten IVDs in 250 &amp; mgr; l Papain-Digestion-Lösung (0,1 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M Cystein-HCl, pH 6,4) über Nacht bei 65 ° C ein Heizblock verwendet wird. </li><li> Zentrifuge Proben für 10 minbei 2000 × g und die überstehende Flüssigkeit sammeln. </li><li> Messen Sie das Proteoglycan-Gehalt des IVD durch die Dimethylmethylen blaue Verwendung (DMMB) -Assay mit Chondroitinsulfat-Standards. </li><li> Bereiten DMMB - Lösung (21 mg DMMB, 5 ml absolutes Ethanol, 2 g Natriumformiat in 1 l ddH 2 O). </li><li> Pipette 30 ul Standards und Proben in dreifacher Ausführung in einer 96-Well-Platte, zusammen mit 250 ul DMMB-Lösung in jeder Vertiefung. </li><li> Die Absorption der Platte bei 525 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Messen Sie den Kollagengehalt eines Hydroxyprolin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li></ol> 7. Histologie <ol><li> Fix eine Teilmenge der Proben in 4% Paraformaldehyd für 24 h, de-verkalken für 48 h in 5% Ameisensäure, Entwässern mit Ethanol und in Paraffin eingebettet werden. </li><li> Unter Verwendung eines Mikrotoms, Abschnitt werden die Proben sagittal bei 10 &amp; mgr; m Dicke und gelten Schnitte an den Glasobjektträger. Beflecken die Abschnitte mit Safranin-O / Fast Green und DAPI. </li><li> Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, Bild gleitet bei 10facher Vergrößerung. </li></ol> 8. Contrast-enhanced microComputed Tomography (microCT) <ol><li> Scannen eine Teilmenge von Proben , die bei den 0, 2, 5 und 7-Tage - Zeitpunkt unter Verwendung von Ioversol Längskontrastverstärkung 10 und dem Anschluss Phosphomolybdänsäure (PMA) Kontrastverstärkung bei dem 7 - tägigen Zeitpunkt. </li><li> 4 h vor dem microCT Abtastzeit, fügt 300 ul 350 mg / ml Jod Ioversol-Lösung zu den Kulturmedien für eine Endkonzentration von etwa 50 mg / mL iodhaltigen Ioversol-Lösung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 4 h. </li><li> Nach der Inkubation wickelt die Probe in steriler Gaze und in einem Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml. </li><li> Die Proben werden in dem System microCT und Scan bei 45 keVp, 177 &amp; mgr; A, 10,5 um Voxel-Größe, und 300 ms Integration. </li><li> Exportieren von Daten aus dem microCT als DICOM-Dateien und visualisieren Software ( <em&gt; zB OsiriX). </li><li> An dem 7-Tage-Zeitpunkt, zu beheben Proben mit einer 4% Paraformaldehydlösung für 24 Stunden unter Verwendung von, gefolgt von 5% PMA-Lösung für 3 Tage, und scannen Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 8.4 verwendet werden. </li></ol> 9. Dreidimensional Finite-Elemente-Modellierung <ol><li> Segment der DICOM - Dateien des IVD unter Verwendung von Software mit manuellem Thresholding (zB OsiriX). </li><li> Konvertieren Sie die NP und AF Volumina des IVD in Voxel-basierten Finite-Elemente-Netze mit Meshlab. </li><li> Kombinieren Sie die Mikrostrukturen des NP und AF eine komplette IVD zu bilden und gilt experimentell bestimmte Randbedingungen in der Finite-Elemente-Software. </li></ol>

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	<li>Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+low+back+pain+cost+of+illness+studies+in+the+United+States+and+internationally.">A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally.</a> Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).</li><li>Urban, J., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertbral+disc.">Degeneration of the intervertbral disc.</a> Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).</li><li>Mirza, S. K., White, A. 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Die Autoren dieses Manuskript zu erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Organkultur des murinen FSU mit dem Schwerpunkt auf die biologischen Veränderungen in der IVD-Überwachung. Die erfolgreiche Aufrechterhaltung dieser Kulturen erfordert eine sorgfältige sterile Techniken. Insbesondere werden die Schritte der Präparation 2,1-2,6 und die Kultur Schritte 3,1-3,6 besondere Sorgfalt erfordern sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, werden beibehalten, und diese Schritte sollten vorzugsweise in einem isolierten Behandlungs...

Schmerzen im unteren Rücken (LBP) ist der führende Faktor für die globale Behinderung und verlorene Produktivität am Arbeitsplatz, und die Amerikaner allein verbringen mehr als 50 Milliarden Dollar für LBP Behandlung 1. Obwohl weit verbreitet, bleibt die Ätiologie von LBP komplex und multifaktoriell. Allerdings ist Bandscheibe (IVD) Degeneration zu den bedeutendsten Risikofaktoren für LBP 2. Der IVD ist aus drei Mikrostrukturen: die äußere Anulus fibrosus (AF), der Innenraum Nucleus pulposus (NP) und zwei knorpeligen Endplatten, die die gesamte Struktur proximal und distal 3 - Sandwich. Mit dem Altern und Degeneration, ändern sich die Komponenten IVD Strukturell kompositionell und mechanisch 4. Diese Änderungen umfassen den Verlust von Proteoglykanen und Feuchtigkeit in der NP, verringerte Scheibenhöhe und verschlechterte mechanische Kompetenz 5. Diese Veränderungen sindoft durch Cytokine begleitet , die eine Entzündungsreaktion, sowie Neutrophilen und Spinalganglien Eindringen in den Gelenkraum kulminiert in einer Kaskade von Ereignissen zu fördern , die 6 bis LBP Symptomen führen. Die Untersuchung der Mechanismen der IVD-Degeneration ist eine Herausforderung beim Menschen, weil es oft nicht möglich ist, die Ursache für die Degeneration vor dem Auftreten von Schmerzen im unteren Rücken zu isolieren. Somit wurde ein reduktionistischen Ansatz , um das experimentelle System zu vereinfachen , bis auf die IVD Organ ermöglicht mechanistische Feinabstimmung der kausalen Variablen und Prüfung ihre nachgelagerten Effekte 5. Das System wird nur die nativen Zellpopulation reduziert und extrazelluläre Matrix umgibt, wodurch die direkte Interpretation der Auswirkungen von äußeren Reizen auf IVD-Degeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen die niedriger Kosten und die Skalierbarkeit von murinen Modellen, sowie die große Anzahl von gentechnisch veränderten Tieren 7, für ter rasch gezielte Screening von IVD degenerative Mechanismen und mögliche Therapien. Hier beschreiben wir ein Maus-Organkultursystem, in der IVD Zell- und Gewebestabilität über 21 Tage gehalten wird, mit besonderem Schwerpunkt auf den IVDs gegeben homeostatic, mechanische, strukturelle und entzündliche Muster. Mit dieser Methode überwachen wir die funktionellen Veränderungen IVDs in einem Stich induziertes Verletzungsmodell 8 , die Mechanismen hinter Scheibendegeneration zu verstehen. Weiterhin beschreiben wir mehrere Anwendungen dieser Organkulturverfahren weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Modellierung des IVD zu leiten.

<table><tbody><tr><td>96 well plate</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92096</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92024</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>25 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94024</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>10 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94010</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>5 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94005</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>500 mL bottle top filters, 22 &amp;micro;m</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99505</td><td>Used for filter media</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140098</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140900</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140920</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Optiray 350</td><td>Guebert</td><td>19133341</td><td>Used for contrast enhanced microCT</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Tetrazolium Blue Chloride</td><td>Sigma</td><td>T4375</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6152</td><td>Used for bioluminescence imaging</td></tr><tr><td>Chondroitin Sulfate</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>10% Phosphomolybdic Acid Solution</td><td>Sigma</td><td>HT152</td><td>Used for contrast enhanced microCT</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma</td><td>S8884</td><td>diluted to .1% concentration (in water)</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>.001% concentration</td></tr><tr><td>Papain from papaya latex</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3125</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Nucleic acid staining</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate Glue</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Adhesive&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>Fischer Scientific</td><td>S348903</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Big Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioDent</td><td>ActiveLife</td><td></td><td>For mechanical testing</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>AxioCam503</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>VivaCT40</td><td>Scanco</td><td></td><td>MicroCT</td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Denver Instrument Company</td><td>A-200DS</td><td>Analytical balance</td></tr><tr><td>Incubator HERAcell 150i</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Organ Culture</td></tr><tr><td>Dissection Scope</td><td>VistaVision</td><td></td><td>Used during dissection</td></tr><tr><td>Laser Micrometer</td><td>Keyence</td><td>LK-081</td><td>Measuring disc height</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td>Used for histology</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>For statistics</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>For modeling</td></tr><tr><td>Osiri-LXIV</td><td>Pixmeo</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>MeshLab v1.3.3</td><td>Visual Computing Lab - ISTI - CNR</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>PreView/FEBio 2.3</td><td>Utah MRL &amp;amp; Columbia MBL</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection Tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Spring Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15000-02</td><td>Or any nice pair of spring scissors</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp&amp;nbsp; (small)</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp&amp;nbsp; (larger)</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11252-40</td><td>At least 2; can also use #3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11150-10</td><td>At least 2</td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps, serrated</td><td>World Precision Instruments</td><td>503719-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps, teeth</td><td>World Precision Instruments</td><td>501244</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #3</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #23</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Insect Pins, size 000</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>27 G Needle</td><td>BD PrecisionGlide Needles</td><td>BD305109</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro organ culture model of the murine intervertebral disc

Bandscheibe (IVD) Degeneration ist ein wichtiger Faktor für Schmerzen im unteren Rücken. Der IVD ist ein fibrocartilagineum Gelenk, das in der Wirbelsäule Lasten zu übertragen und dämpfen dient. Der IVD besteht aus einem Proteoglycan reichen Nukleus pulposus (NP) und einem kollagenreichen Anulus fibrosus (AF) von knorpeligen Endplatten sandwichartig angeordnet. Zusammen mit den benachbarten Wirbeln, bildet die Wirbel-IVD-Struktur mit einer funktionellen Wirbelsäuleneinheit (FSU). Diese Mikrostrukturen enthalten einzigartige Zelltypen sowie einzigartige extrazellulären Matrix. Ganz Organkultur der FSU bewahrt die native extrazellulären Matrix, Zelldifferenzierung Phänotypen und zelluläre-Matrix-Interaktionen. Somit sind Organkultur-Techniken besonders nützlich für die komplexen biologischen Mechanismen des IVD zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen High-Throughput-Ansatz zur Kultivierung gesamte Lendenwirbel Maus FSU, die für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Therapien für die IVD eine ideale Plattform zur Verfügung stellt. Darüber hinaus beschreiben wir siele Anwendungen, die diese Organkulturverfahren nutzen weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Finite-Elemente-Modellierung des IVD zu leiten.

Figuren 2-3 zeigen repräsentative Ergebnisse von Proteoglycan Verteilung, NF &amp; kgr; B Expression, Steifigkeit, Viskosität, Scheibenhöhe und Naßgewicht für kultivierte Maus IVDs. Wenn sie richtig kultiviert, werden die IVD Parameter der Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden von der Frische-Gruppe. Wenn die Kultur infiziert ist oder auf andere Weise beeinträchtigt, wird die Kontrollgruppe aus der Frischen Gruppe unterschiedlich sein, vor allem in NF-kappaB-Expression und Proteoglykan Vert...

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An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

an-in-vitro-organ-culture-model-of-the-murine-intervertebral-disc

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

9.5K Aufrufe.  Washington University in St. Louis.  Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen. 

Serie: An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give flexibility to the spine. It composes of three compartments: the innermost nucleus pulposus (NP) encompassing by the annulus fibrosus (AF), and two cartilaginous endplates connecting the NP and AF to the vertebral body on both sides. Discogenic pain possibly caused by degenerative intervertebral disc disease (DDD) and disc herniations has been identified as a major problem in our modern society. To study possible mechanisms of IVD degeneration, in vitro organ culture systems with live disc cells are highly appealing. The in vitro culture of intact bovine coccygeal IVDs has advanced to a relevant model system, which allows the study of mechano-biological aspects in a well-controlled physiological and mechanical environment. Bovine tail IVDs can be obtained relatively easy in higher numbers and are very similar to the human lumbar IVDs with respect to cell density, cell population and dimensions. However, previous bovine caudal IVD harvesting techniques retaining cartilaginous endplates and bony endplates failed after 1-2 days of culture since the nutrition pathways were obviously blocked by clotted blood. IVDs are the biggest avascular organs, thus, the nutrients to the cells in the NP are solely dependent on diffusion via the capillary buds from the adjacent vertebral body. Presence of bone debris and clotted blood on the endplate surfaces can hinder nutrient diffusion into the center of the disc and compromise cell viability. Our group established a relatively quick protocol to "crack"-out the IVDs from the tail with a low risk for contamination. We are able to permeabilize the freshly-cut bony endplate surfaces by using a surgical jet lavage system, which removes the blood clots and cutting debris and very efficiently reopens the nutrition diffusion pathway to the center of the IVD. The presence of growth plates on both sides of the vertebral bone has to be avoided and to be removed prior to culture. In this video, we outline the crucial steps during preparation and demonstrate the key to a successful organ culture maintaining high cell viability for 14 days under free swelling culture. The culture time could be extended when appropriate mechanical environment can be maintained by using mechanical loading bioreactor. The technique demonstrated here can be extended to other animal species such as porcine, ovine and leporine caudal and lumbar IVD isolation.

This protocol illustrates a harvesting technique for coccygeal bovine intervertebral discs for organ culture for in vitro organ culture.

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous animal models of intervertebral disc degeneration have been developed. The ideal animal model should closely mimic the human intervertebral disc with regard to morphology, biomechanical properties and the absence of notochordal cells. The sheep lumbar intervertebral disc model fulfils these criteria. We present an ovine model of intervertebral disc degeneration utilizing a drill bit injury through a lateral retroperitoneal approach. The lateral approach significantly reduces the incision and potential morbidity associated with the traditional anterior approach to the ovine spine. Utilization of a drill-bit method of injury affords the ability to produce a consistent and reproducible injury, of precise dimensions, that initiates a consistent degree of intervertebral disc degeneration. The focal nature of the annular and nucleus pulposus defect more closely mimics the clinical condition of focal intervertebral disc herniation. Sheep recover rapidly following this procedure and are typically mobile and eating within the hour. Intervertebral disc degeneration ensues and sheep undergo necropsy and subsequent analysis at periods from eight weeks. We believe that the drill bit injury model of intervertebral disc degeneration offers advantages over more conventional annular injury models.

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to back pain and a leading cause of disability worldwide. Numerous animal models of intervertebral disc degeneration exist. We demonstrate an ovine model of intervertebral disc degeneration, utilizing a drill bit, which achieves a consistent disc injury and reproducible level of disc degeneration.

Schaf-Lendenwirbelsäulen-Degenerationsmodell mit einer lateralen Retroperitoneal-Bohrer-Verletzung

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

Medizin

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due to the lack of causative therapies, there is an urgent need for innovative experimental organ culture models to study the mechanisms involved in the progression of the disease, find therapeutic targets, and reduce the need for animal models. We here present a novel, three-dimensional organ culture model protocol mimicking the proinflammatory and catabolic microenvironment, which is present during IDD. 
Initially, bovine caudal IVDs were dissected, cleaned, and cultured in the tissue culture medium. Dynamic physiologic or pathologic loading was applied in a custom-made bioreactor for 2 hours per day. IVDs were assigned to a control group (high glucose medium, physiological loading, phosphate-buffered saline injection) and a pathological group (low glucose medium, pathological loading, tumor necrosis factor-alpha injection) for four days. Gene expression analysis from collected nucleus pulposus cells of the IVDs and enzyme-linked immunosorbent assay of the conditioned organ culture media was performed. 
Our data revealed a higher expression of inflammatory markers and reduced disc heights after loading in the pathological group compared to the control group. This protocol is reliable to simulate IVD inflammation and degeneration and can be further expanded to broaden its application scope.

This protocol presents a novel experimental model of proinflammatory, degenerative bovine organ culture to simulate early-stage intervertebral disc degeneration.

Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To decode disc degeneration and to be able to develop regenerative approaches a thorough understanding of the cellular biology of the IVD is essential. One aspect of this biology that still remains unanswered is the question of how cells are spatially arranged in a physiological state and during degeneration. The biological properties of the IVD and its availability make this tissue difficult to analyze. The present study investigates spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus from early embryonic development to end-stage degeneration. An optical sectioning method (Apotome) is applied to perform high resolution staining analyses using bovine embryonic tissue as an animal model and human disc tissue obtained from patients undergoing spine surgery. From a very high chondrocyte density in the early embryonic bovine disc, the number of cells decreases during gestation, growth, and maturation. In human discs, an increase in cellular density accompanied the progression of tissue degeneration. As had already been demonstrated in articular cartilage, cluster formation represents a characteristic feature of advanced disc degeneration.

We present a method to investigate spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus of the intervertebral disc using an optical sectioning method.

Optische Schnittung und Visualisierung der Bandscheibe von der Embryonalentwicklung bis zur Degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

Biologie

Generating a Pro-Inflammatory Organ Culture Model to Simulate an Early Intervertebral Disc Disease

Source: Saravi, B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62100">A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a technique for culturing bovine intervertebral discs in bioreactors to develop a three-dimensional organ culture model. Specific nutrient-deprived media and degenerative pressure conditions are applied to the discs, mimicking the pro-inflammatory and degenerative microenvironment observed during early-stage intervertebral disc disease. The disc heights are measured post-treatment to analyze the effects of nutrient deprivation and degenerative loading.

Generierung eines pro-inflammatorischen Organkulturmodells zur Simulation einer frühen Bandscheibenerkrankung

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Dissection of the bovine ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Generating an Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease

Source: Saravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62100">A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the development of a pro-inflammatory and degenerative organ culture model for early-stage intervertebral disc (IVD) disease using TNF-&#945;. It outlines the procedure for injecting TNF-&#945; into the intervertebral disc and explains the mechanisms through which TNF-&#945; induces inflammation and degradation of the IVD.

Source: Saravi, B. et al., A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.&#160;J. Vis. Exp. ...

Ein

Zusammenfassung

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