Die HBV-Virusreplikation bei der Extrahepatie spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von extrahepatischen Syndromen. Derzeit sind Zellkulturmodelle für den Beginn einer extrahepatischen HBV-Infektion begrenzt. Wir präsentieren ein in vitro nicht-hepatisches Infektionsmodell, um neuartige Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die HBV-Replikation beeinflussen, und HBV-bedingte Nierenerkrankungen zu untersuchen.
Im Vergleich zu herkömmlichen HBV-Infektionsmodellen haben wir 293T-Zelllinie, 293T-NE-3NR, übernommen und entwickelt und mit HepG2.2.15 kokultiviert. HBV-Infektion sollte in einem Labor der Biosicherheitsstufe zwei oder der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle Forscher sollten geimpft werden und HBS-Antikörper positiv erkennen, bevor hBV-Experimente durchgeführt werden.
Beginnen Sie mit der Kultivierung der HepG2.2.15-Zellen unter Berücksichtigung, dass die Zellüberstand sowie alle Spitzen, Kolben, Platten und Röhren, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten in 2%Virucide über Nacht vor der Entsorgung eingeweicht werden. Entfernen Sie die Durchstechflasche mit HepG2.2.15-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auf. Übertragen Sie die Zellen auf einen 25 Zentimeter großen quadratischen Gewebekulturkolben und fügen Sie vier Milliliter komplettes Kulturmedium hinzu.
Kultur die HepG2.2.15 Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Wenn Sie bereit sind, sammeln Sie den Zellüberstand in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr.
Schließen Sie den Deckel fest und wickeln Sie ihn mit Paraffinfolie. Um die Zellfragmente zu entfernen, filtern Sie den HepG2.2.15 Überstand mit einer 0,45 Mikrometer Membran in ein neues 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Dann 14 Milliliter gefilterten Überstand zu einer Viruskonzentratorspalte hinzufügen und den Deckel schließen.
Zentrifugieren Sie die Säule 3,200 mal g für 35 Minuten in einer horizontalen Spinnzentrifuge und sammeln Sie das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Führen Sie Echtzeit-PCR aus, um sicherzustellen, dass die Konzentration, wenn die HBV-DNA im HepG2.2.15 Überstandkonzentrat innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt. Verdünnen Sie das Konzentrat 20-fach, indem Sie 10 Mikroliter zu 190 Mikroliter DMEM in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.
Zusammen mit dem Überstandkonzentrat eine Negative Kontrolle, eine positive Kontrolle und vier Verdünnungen der quantitativen Referenz vorbereiten. Fügen Sie 450 Mikroliter HBV-DNA-Extraktionspuffer zu jeder Probe hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie 27 Mikroliter PCR-Master-Mix und drei Mikroliter Taq-Polymerase-Enzym pro Probe in PCR-Röhren, die auf Eis gelegt werden.
Dann fügen Sie 20 Mikroliter der zentrifugierten Probe zu jedem Rohr hinzu. Führen Sie Echtzeit-PCR nach Manuskriptrichtungen aus und exportieren Sie die CT-Werte, um eine Standardkurve zu erhalten. Das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in Aliquots aufteilen und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es einsatzbereit ist.
Bereiten Sie Infektionsmedium nach Manuskript Richtungen. Dann Säen HepG2-NE in zwei Brunnen, 293T-NE-3NR-Zellen in zwei Brunnen, und 293T-NE in einem Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator für 24 Stunden.
Nach der Inkubation beobachten Sie die Zellen und gehen Sie mit der Infektion fort, wenn sie gesund sind. Fügen Sie 500 Mikroliter des Infektionskomplexes zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikroliter PBS.
Dann fügen Sie einen Milliliter Medium zu jedem Brunnen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage sanft. Waschen Sie die Zellen an Tag 11 vorsichtig zweimal mit 500 MikroliterPBS und fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz.
Samen 100. 000 Zellen pro Bohrkörper von HepG-NE in zwei Brunnen, 293T-NE-3NRs in zwei Bohrungen und 293T-NE in einem Brunnen der Platte. Samen 100.000 Zellen pro Bohrkörper von HepG2.2.15 in fünf Membraneinsätze in einer separaten Sechs-Brunnen-Platte. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden.
Stellen Sie nach der Inkubation sicher, dass die Zellen alle haftbar und in gutem Zustand sind. Entsorgen Sie das Medium in der Sechs-Brunnen-Platte und die Zellmembraneinsätze. Dann legen Sie die Membraneinsätze mit HepG2.2.15 in die mit HepG-NE, 293T-NE-3NRs und 293T-NE gesäte Sechs-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator, wodurch sich das Medium alle drei bis vier Tage ändert. Nach 10 Tagen die Membraneinsätze entfernen, die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen und die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz fixieren. Die Inkubation mit dem primären HBcAg-Antikörper und DAPI führte zu einer deutlichen Färbung, wenn sie mit einem 10-fachen Objektiv auf einem fluoreszierenden invertierten Mikroskop beobachtet wurde.
Die kerntechnische Lokalisierung wurde durch Färbung mit DAPI bestätigt und die NTCP-EGFP-Expression wurde mit grüner Fluoreszenz identifiziert. Die Expressionsstellen von HBcAg befanden sich mit roter Fluoreszenz. Wenn sich DAPI, NTCP und HBcAg in derselben Zelle befinden, wurde die Zelle erfolgreich mit HBV infiziert.
Die Cyclosporin-A-Gruppe war die negative Kontrolle, da sie verhindert, dass HBV durch Blockieren von NTCP in Zellen eindringt. HBcAg wurde in 293T-NE-3NRs nachgewiesen, aber nicht in 293T-NE-Zellen, was darauf hinweist, dass NTCP nicht der einzige faktor ist, der für eine HBV-Infektion bei 293T unerlässlich ist. Ein guter Zellstatus und ein effizienter Betrieb sind die Schlüsselpunkte für erfolgreiche Infektionsergebnisse.
Auch das sanfte Waschen und Medienwechsel nach der Infektion ist wichtig. Als Alternative, HBV-Infektionsmethode mit Hepatoma-basierten HepG2-NE-Zellen hat eine höhere Infektionseffizienz als diese Methode und eignet sich für Anti-HBV-Arzneimittel-Screening. Die Modellierung einer HBV-Infektion in 293T-NE-3NR ist aufgrund des nicht-hepatischen Hintergrunds dieser Zellen ein nützliches Kompliment für das traditionelle Zellmodell.
Diese Methode wird die Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen Zellen sowie Wirtsfaktoren für die Leber von HBV erforderlich erleichtern.
