Die Autoren sind sehr dankbar, dass Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), der als Erzähler fungierte, sowie Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) und Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) für ihre Hilfe mit der Herstellung der diese Handschrift begleitenden Film. Weiterhin möchten wir Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) für kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NIH, NIAID unterstützt.

1. Aufteilung des Produktionszellen für anfänglichen Produktion von trVLPs <ol><li> Entfernen Medium von 80-90% konfluenten 293 Zellen in 75 cm 2-Kolben kultiviert in hohem Glucose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin (DMEM10 ). Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), darauf achten, um die Zellen zu entfernen, und 2 ml Trypsin-EDTA zu den Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen bei Raumtemperatur, bis die Zellen zeigen deutliche Rundung, wenn sie unter einem Mikroskop (ca. 30 sec) beobachtet. Zellen zu entfernen, indem Sie auf Kolben und 8 ml DMEM10. Gründlich resuspendieren durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, bis eine Einzelzellsuspension wird beobachtet, wenn unter dem Mikroskop betrachtet. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines automatisierten Zellzähler. Verdünnte Zellen zu 2 x 10 5 Zellen pro ml in DMEM10. Pipette 2 ml Zellsuspension pro Well in 6-Well-Platten (4 x 105 Zellen pro Vertiefung). </li><li> Die Platten in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 2. Transfektion von Zellen für Produzent anfänglichen Produktion von trVLPs <ol><li> 24 Stunden nach der Spaltung der Zellen (siehe Abbildung 5 für einen Überblick über das Experiment Timing), Pipetten Plasmid-DNA 15 (für Beträge siehe Tabelle 1) in ein steriles 2 ml Kryoröhrchen mit Filterspitzen. 100 l pro OptiMEM gut an die DNA. Vortexen die Mischung kurz und sanft nach unten drehen die Rohre mit Hilfe einer Mikro. Wenn mehrere Vertiefungen sind mit identischen Plasmiden transfiziert werden, kann ein Mastermix für mehrere Vertiefungen gebildet werden. </li><li> Vortexen Sie das Fläschchen mit Transit LT1 vor dem Gebrauch. Fügen 7,5 ul Transit LT1 pro Vertiefung zu der verdünnten DNA. Vortexen Sie vorsichtig die Mischung, kümmert sich nicht um Flüssigkeit im Deckel des Cryovial sammeln, und die Proben für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig mischen die TransfektionKomplex durch Pipettieren von oben und unten. 100 l der Transfektionskomplexe tropfenweise in jede Vertiefung. Rock die Platte vorwärts / rückwärts und von Seite zu Seite, um die Transfektionskomplexe zu verteilen. Die Platte wirbeln nicht, da dies zu einer ungleichmäßigen Verbreitung der Transfektionskomplexe. </li><li> Rückkehr der Zellen in den Inkubator. </li><li> Nach 24 Stunden, entfernen Sie den Überstand von Zellen. 4 ml DMEM mit 5% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin (DMEM5) zu den Zellen. Dieser Schritt kann bis zu 3 Vertiefungen in einer Zeit ohne Trocknen der Vertiefungen ausgeführt werden, vorausgesetzt, die Löcher enthalten identische Proben (ansonsten aufgrund der selbstverstärkenden Art der trVLPs in diesem System kann eine Kreuzkontamination zu einem Problem werden und Dieser Schritt sollte man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt). </li><li> Rückkehr der Zellen in den Inkubator. </li></ol> 3. Herstellung von Zielzellen <ol><li> Split 293-Zellen, wie in Abschnitt 1 pro Vertiefung einer beschrieben, der Aussaat 4 x 10 5 Zellen in 2 ml DMEM106-Well-Platte. </li><li> 24 Stunden nach der Aufspaltung der Zielzellen und 24 Stunden vor der Infektion, Transfektion von Zielzellen, wie in Kapitel 2 unter Verwendung der DNA beschriebenen Mengen in der Tabelle 1 und 4,5 ul Transit LT1 pro Vertiefung. </li></ol> 4. Die Infektion der Zielzellen und Ernte von Produktionszellen <ol><li> Die Überstände aus den Produzentenzellen bis 15-ml-Röhrchen. Entfernen Sie alle verbleibende Überstand mit einem Vakuumschlauch. Fügen Sie 250 ul Glo Lyse-Puffer zu den Zellen. </li><li> Zentrifugenüberstand für 5 min bei 800 × g und Raumtemperatur, um die Proben der Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Entfernen des Überstandes von einer Vertiefung der Zielzellen. Vorsichtig 3 ml gelöscht Produzent Zellüberstand, um Zellen mit der langsamsten Geschwindigkeit Pipette Ziel. Vermeiden Pipettieren direkt auf die Zellen, um zu vermeiden Aufbrechen der Zellmonoschicht. Dieser Schritt muss man gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt. </li><li> Wenn alle Proben wurden transVorzugs, kehren die Zielzellen in den Inkubator zu Sedimentation trVLPs und Infektion der Zielzellen zu ermöglichen. </li><li> Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur in der Glo-Lyse-Puffer, resuspendieren Produzentenzellen in der Lyse-Puffer mit einer Mikropipette zu 150 ul eingestellt, und übertragen Sie die Probe in ein 2 ml Kryoröhrchen. An diesem Punkt können Lysate bei -80 ° C eingefroren oder direkt gemessen, wie in Abschnitt 6 beschrieben. </li><li> 24 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den Überstand von den Zielzellen. 4 ml pro Vertiefung DMEM5 zu den Zellen. Dieser Schritt kann bis zu drei Vertiefungen in einer Zeit durchgeführt werden, wenn die Vertiefungen identische Proben (ansonsten aufgrund der selbstverstärkenden Art der trVLPs in diesem System kann eine Kreuzkontamination zu einem Problem werden, und dieser Schritt sollte Ein gut durchgeführt zu einem Zeitpunkt). </li></ol> 5. Ernte von Zielzellen für eine Single Cycle-Infektion <ol><li> Wenn nur eine einzige Infektionszyklus sollte beurteilt werden, bei 72 Stunden nach der Infektion zu entfernen ter Stand von den Zielzellen mit einem Vakuumschlauch. </li><li> Ernten Sie die Zellen in 250 ul Glo Lyse-Puffer, wie in Kapitel 4 für Produzentenzellen beschrieben. </li></ol> 6. Ernte der Zielzellen und Dauer Passagierung von trVLPs <ol><li> Wenn trVLPs kontinuierlich agiert werden, bereiten eine neue Reihe von Zielzellen, wie in Kapitel 3 beschrieben, so dass sie bereit sind für die Infektion 72 Stunden nach der Infektion des ersten Satzes von Zielzellen (siehe Abbildung 5) sind. </li><li> Infizieren den neuen Satz von Zielzellen, wie in Abschnitt 4 beschrieben (unter Verwendung des ersten Satzes von Zielzellen anstelle der Produzentenzellen). </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte alle 72 Stunden. </li></ol> 7. Analyse der Reporteraktivität <ol><li> Wenn Zelllysate wurden eingefroren, aufgetaut bei Zimmertemperatur. Stellen Sie sicher, dass Proben Raumtemperatur vor der Messung erreicht. </li><li> Tauen die erforderliche Menge (40 ul pro Probe) von Renilla Glo Assay-Puffer (idealerweise eingefroren in Aliquote) bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die Pufferraumtemperatur vor der Messung erreicht hat. </li><li> Fügen 1/100 Volumen von Renilla Glo Substrat auf die Renilla Glo Assay-Puffer zu Renilla Glo Reagenz zu erhalten, und durch Vortexen mischen. Pipette 40 ul der Renilla Glo Reagens in einer weißen 96-Well-Platte. </li><li> Dann werden 40 ul der Probe auf die Renilla-Glo Reagenz. 10 Minuten warten, dann mit einer Integrationszeit von 1 s gemessen, die Proben in ein Luminometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die in diesem Manuskript beschrieben tetracistronic trVLP Assay ermöglicht die Modellierung des Ebola-Virus-Lebenszyklus über mehrere Infektionszyklen. Wichtig ist, die in diesem System produziert trVLPs enthalten nicht die genetische Information für die Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30 und L, die zusammen fast 60% des Ebola-Virus-Genom und sind essentiell für die virale Replikation. Vielmehr müssen diese Proteine ​​in Zielzellen in trans von Expressionsplasmiden zur Verfügung gestellt werden, und jede Infektion der Zellen nicht exprimiert alle 4 dieser Proteine ​​fehl. Wichtig ist, gibt es keine Hinweise auf die genetische Rekombination für Filoviren, und es gibt keine homologen Bereiche zwischen tetracistronic Minigenom und den Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid-Proteinen geteilt. Deshalb gibt es weder eine praktische noch eine theoretische Beweise Basis, die für die Möglichkeit der Erzeugung von voller Länge Ebola-Virus-Genome, die dann möglicherweise in Folge haben könnte bieten könntedie Produktion von infektiösen Viren Ebola, so dass dieses System sicher für den Einsatz unter BSL2- Bedingungen. Es gibt zwei wichtige Schritte in der tetracistronic trVLP Test, der von experimentellen Bedingungen beeinflusst werden, also die Produktion von trVLPs, und die Infektion der Zielzellen mit diesen trVLPs. Herstellung von trVLPs abhängt hohen Minigenom-Replikation und-Transkription, der wiederum von einem hohen Transfektionseffizienz. Transfektionseffizienz leicht, indem ein L Steuerung, bei der das Expressionsplasmid für L ist für ein Expressionsplasmid eGFP codiert ausgetauscht bewertet. Transfektionsraten unter diesen Bedingungen sollte durch Inspektion mit einem Fluoreszenzmikroskop 24 Stunden nach der Transfektion 50% überschreiten. Weiterhin haben Zellen frei von Mykoplasmen zu sein, da nach unserer Erfahrung Mykoplasmen-Kontaminationen dramatisch beeinträchtigt Minigenom-Replikation und Transkription (unveröffentlichte Daten). Aufgrund ihrer hohen Transfizierbarkeit 293 cells sind die Zelllinie der Wahl für trVLP Assays; Jedoch sind diese Zellen relativ schlecht anfällig (wenn auch nicht vollständig Brechungs) nach Infektion mit Ebola-Virus 16. Expression eines Befestigungsfaktor, wie Tim-1 erhöht Infektion von 293-Zellen mit trVLPs etwa 100-fach, und ist entscheidend für den Erfolg dieses Systems über mehrere Passagen. Während tetracistronic trVLPs nicht selbst replizieren auf ihre eigenen, sie sind selbst replizieren in Zellen, die die Nukleokapsidproteine ​​auszudrücken. Als solche müssen Vorkehrungen getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen den Wells mit verschiedenen trVLPs (zB mit unterschiedlichen Mutationen im Minigenom) zu vermeiden. Von einem technischen Standpunkt aus gesehen, aufgrund der großen Differenz zwischen positiven und negativen Signalen in diesem Assay (ca. 4 Stamm), ein Übersprechen zwischen den Proben bei der Messung der Luciferase-Aktivität, kann ein Problem sein; dies kann jedoch leicht durch Verlassen einer leeren Brunnen zwischen jeder Probe in die vermieden werden96-Well-Platte für die Messung Luciferase-Aktivität verwendet. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für tetracistronic trVLPs. Offensichtlich sind sie gut geeignet für die Untersuchung der Eingabe filovirus Teilchen, da Infektions trVLPs die typische gewindeartigen Struktur von Infektions Filoviren 14 und enthalten die gleichen Komponenten, wie virale Partikel filovirus. Wichtig ist, die nicht Bestandteil anderer Viren enthalten, wie es der Fall bei der Verwendung von pseudotypisierten Virionen oder virusartigen Partikeln, wie Retroviruspartikel tragenden GP 1,2 oder rekombinanten Viren, wie rekombinantes Virus der vesikulären Stomatitis exprimieren GP 1,2 . Die Anforderung für die Befestigung Faktoren bei der Verwendung 293-Zellen als Zielzellen in diesem System können zum Screening genutzt und untersuchen die Rolle solcher Haftungsfaktoren, während die Rollen der anderen zellulären Faktoren, wie die in der Genom-Replikation und Transkription beteiligt sowie Morphogenese und Knospeding, kann mit Hilfe der RNAi-Technologie untersucht werden. Der Effekt von Mutationen in der viralen Proteine ​​auf der Viruslebenszyklus kann auch untersucht werden, auch wenn man im Hinterkopf behalten, dass, während VP40, GP 1,2 und VP24 sind nach der viralen Transkription ausgedrückt, wird die Expression der viralen Proteine ​​von anderen Ausdruck erreicht Plasmide, so dass Effekte aufgrund der Überexpression dieser Proteine ​​müssen berücksichtigt werden. Außerdem sollte darauf geachtet werden, dass Mutationen in der Minigenom nicht wesentlich über die Länge des Minigenoms ändern, da die Reporteraktivität direkt von Minigenom Länge 15 berührt. Da schließlich tetracistronic Minigenome sind virale Genom-Analoga, die Virusgene tragen, und werden durch die virale Polymerase-Komplex repliziert, sollte es auch möglich sein, um die Entwicklung dieser Gene als Antwort auf Mutationen unter BSL2 Bedingungen zu studieren. Während also noch weitere Studien in dieser Richtung erforderlich ist, sollte es möglich sein, beispielsweise zur Einführung suboptimalMutationen in Genen innerhalb der Minigenom und dann Durchgang, bis trVLPs kostenlose Mutationen entstehen. Eine Einschränkung des tetracistronic trVLP Assay, der beachtet werden muss, ist die Tatsache, dass, während es die meisten Modelle des Virus-Lebenszyklus, primäre Transkription in Zielzellen wird durch dieses System nicht modelliert, da die Zielzellen haben, die Nucleocapsid-Proteine ​​in trans auszudrücken Damit die trVLPs zu replizieren. Wenn primäre Transkription ist zu bewerten, ist es möglich, naive Zielzellen 10 zu verwenden; aber in diesem Fall kein Genom-Replikation in Zielzellen erfolgt und keine weiteren infektiösen trVLPs erzeugt, Abbrechen der Infektion. Dies ist ein Hauptproblem, das nicht ohne Rendering die trVLPs komplett selbst replizieren, indem die Gene für die Proteine ​​in das Nukleokapsid Minigenom, die de facto machen sie zu infektiösen rekombinanten Viren Ebola würde überwunden werden können. Tatsächlich EbolA-Viren exprimieren Luciferase oder andere Reporter wurden generiert und können verwendet werden, um zu beurteilen und zu studieren Genom-Replikation und Transkription werden 17,18; allerdings ist ihr Einsatz auf BSL4 Labors beschränkt. Außerdem hat es zu berücksichtigen, dass während VP40, GP 1,2 und VP24 von einem viralen Genoms analogen Ausdruck, ihre Position in der Minigenom gehalten werden (2., 3., und 4. Transkriptionseinheit) ist nicht identisch mit ihre Position in dem viralen Genom (3., 4., 6. und Transkriptionseinheit), die die absolute Expressionsniveaus sowie ihre relativen Expressionsniveaus gegeneinander beeinflussen. Insgesamt ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren bisher verfügbaren und ermöglicht die Modellierung von Genom-Replikation und Transkription, Partikel Morphogenese und angehenden sowie Befestigung und enversuchen in Zielzellen über mehrere Infektionszyklen. Als solche hat sie ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren unter BSL2- Bedingungen.

Ebola-Viren sind die Erreger einer schweren hämorrhagischen Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, die mit Letalität von bis zu 90% in der menschlichen Ausbrüche 1. Zwar gab es in den letzten Jahren in die Entwicklung von Impfstoffen sowie spezifische Behandlungen (in 2,3 bewertet) wurden erhebliche Fortschritte erzielt, so werden diese nicht für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Ebola-Virus-Partikel haben eine charakteristische fadenartiges Aussehen mit einer Länge von etwa 1 um und einen Durchmesser von 96 bis 98 nm 4. Ein Nukleokapsid bildet den Kern der Viruspartikel und besteht aus 1) dem nicht-segmentierten Einzelstrang-negativen Sense-RNA-Genom, das die 7 Ebolavirus-Gene codiert (Figur 1), 2) das Nucleoprotein NP, die das Genom encapsidates, 3 ) der viralen Polymerase-Komplex, bestehend aus der Polymerase-L und dessen Cofaktor VP35, und 4) die transkriptionelle Aktivator VP30. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein VP24 ist mit Nukleokapsid assoziierts 4. Das Nukleokapsid ist von dem Matrixbereich, in dem das Matrix-Protein VP40, die für die Morphogenese und Knospung von Virionen verantwortlich ist, befindet sich umgeben. Viruspartikel werden weiter umhüllt und in diesem Umschlag eingebettet ist die einzige Oberflächenprotein GP 1,2, die Virion Befestigung und Eintrag verantwortlich ist. Arbeit mit infektiösen Viren Ebola muss in einem Hochsicherheitslabor unter Biosicherheitsstufe (BSL) 4 Bedingungen, die diese Arbeit auf einige wenige Standorte weltweit beschränkt durchgeführt werden. Um die Biologie dieser Viren zu studieren oder neue Therapeutika in BSL2- Bedingungen zu entwickeln, setzen die Forscher entweder auf die Überexpression von rekombinanten Proteinen Ebola-Virus, oder Lebenszyklus-Modellierungssysteme, die beide mit in der Abwesenheit von Infektions Ebola-Virus gearbeitet werden. Rekombinante Expression von Ebola-Virus-Proteine ​​entweder von Expressionsplasmiden oder viralen Vektoren erreicht. Ein Sonderfall dieser Strategie ist dieErzeugung von Virionen oder Virus-ähnliche Partikel auf Basis von anderen Viren als Ebola-Viren (üblicherweise Retroviren oder vesikulären Stomatitis-Virus) in Gegenwart von 1,2 GP rekombinant exprimiert, was zur Erzeugung von pseudotypisierten Partikel, die verwendet werden können, um die Studie Eintrag Prozess der Filoviren und Leinwand für Entry-Inhibitoren 5. Alternativ können rekombinante Viren (zB, vesikuläre Stomatitis-Virus), die das Ebola-Virus GP 1,2 ihrer eigenen Glykoprotein codieren statt erzeugt und verwendet werden, um das Eindringen von Viren unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen 6 studieren. Lifecycle Modellierungssysteme sind Formen der reversen Genetik Systeme mit dem Einsatz von Ebola-Virus-Genom abgeschnitten Analoga (Minigenome), der zunächst aus cDNA hergestellt werden und dann repliziert und vom Ebola-Virus-Proteine ​​in trans bereitgestellt transkribiert. Die erste Minigenom-System für Ebola-Virus wurde vor mehr als 15 Jahren entwickelt, 7Und ist seit verwendet worden, um Ebola-Virus-Genom-Replikation und Transkription (in 8,9 bewertet) studieren. In diesem System wird ein monocistronisches Minigenoms aus einer einzigen Reportergens durch das Endgerät nicht-kodierenden Regionen des Ebola-Virus-Genom flankiert (als Leader und Trailer) (Abbildung 1) wird in Säugerzellen (in der Regel durch Transkription mit T7-RNA-Polymerase) exprimiert zusammen mit den viralen Proteinen L, VP35, VP30 und NP. Die Minigenom durch NP eingekapselt und dann repliziert und transkribiert von den anderen Nucleocapsid-Proteine ​​unter Verwendung von cis-wirkenden Signale in dem Leader und Trailer lokalisiert, was zu einer Reporteraktivität, die diese beiden Aspekte des Virus-Lebenszyklus (Figur 2) reflektiert. Um zusätzliche Schritte des viralen Lebenszyklus, der Transkription und replikationskompetenten Virus-ähnliche Partikel (trVLP) Systeme entwickelt worden, die auf klassischen Minigenom Systeme beruhen Modell, sondern sind mit der einW eitere Ausdruck der anderen viralen Proteine ​​VP24, VP40 und GP 1,2 von Expressionsplasmiden 10,11. Die Anwesenheit von VP40 führt zur Bildung von trVLPs, die GP 1,2 auf ihrer Oberfläche tragen, und führen einen Minigenom enthaltenden Nukleokapsid auf der Innenseite. Diese trVLPs kann verwendet werden, um Zielzellen, die entweder mit Expressionsplasmiden für L, VP35, VP30 und NP pretransfected wurden, zu infizieren, um die Replikation und Transkription des Minigenome in die Zielzellen gebracht innerhalb trVLPs 11 zu erleichtern, oder naiven Zielzellen (dh ohne Plasmid-gesteuerte Expression des Ebola-Virus-Proteine) 10. Dies führt Reporteraktivität in Zielzellen, die die Replikation der Minigenome in den Erzeugerzellen Morphogenese und Knospung trVLPs, deren Eintritt in die Zielzellen zeigt, und 1) in dem Fall pretransfected Zielzellen auch Genomreplikation und sekundären Transkription ( dh Transkription von viraler Proteine ​​produced in Zielzellen) in Zielzellen, oder 2) im Falle von naiven Zielzellen auch primäre Transkription (dh Transkription von viralen Proteinen in trVLPs in Zielzellen gebracht) (Abbildung 3). Wichtig ist, daß diese Systeme nur verwendet, um einen einzigen Infektionszyklus zu modellieren, und verlassen sich auf die Überexpression von allen viralen Proteinen, die im Fall von VP24 und VP40 ist besonders problematisch, da diese Proteine ​​wurde gezeigt, dass starke negative Regulatoren der Genom-Replikation sein und wenn die Transkription von Plasmiden 12,13 überexprimiert. Ferner trVLP Vorbereitungen in diesen Systemen hergestellt werden, enthalten einen hohen Anteil an nicht-infektiösen Partikeln, posiert Herausforderungen für die biochemische Analyse von Infektions trVLPs 14. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir vor kurzem ein tetracistronic Minigenom System, das zusätzlich zu einem Reporter-Gen, enthält auch die Gene, die für VP40, GP 1,2 und entwickelteVP24 (Abbildung 1). Ähnlich dem klassischen monocistronisches Minigenom System führt dieses System für die Herstellung von trVLPs die Zielzellen infizieren können (Figur 4) 15. Im Gegensatz zur klassischen Minigenom System VP40, GP 1,2 und VP24 sind nach der viralen Genom-Transkription anstatt von Plasmiden überexprimiert hergestellt. Als Ergebnis wird die Kinetik und die Expressionsniveaus dieser Proteine ​​viel enger imitieren die während des viralen Lebenszyklus festgestellt und damit das Verhältnis von infektiösen nicht-infektiösen trVLPs wird in diesem System 15 um etwa 500-fach. Ferner wurde unter Verwendung dieses Systems war es möglich, kontinuierlich Passage tetracistronic Minigenom haltigen trVLPs, Modellieren mehrerer Infektionszyklen. Als solche sind tetracistronic trVLPs derzeit umfassendste Lebenszyklus Modellierungssystem zur Verfügung zu Ebola-Virus Biologie unter BSL2- Bedingungen zu studieren. Hier informieren wir Sie ausführlich über den Einsatz of dieses Systems sowie der erwarteten Ergebnisse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

Ebola-Viren verursachen schwere hämorrhagische Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, mit Letalität so hoch wie 90%. Es gibt keine zugelassenen Impfstoffe oder spezielle Behandlungen für die Erkrankung, die durch diese Viren verursacht, und die Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt, die Forschung zu diesen Viren erheblich einschränkt. Lebenszyklus-Modell, Modellierungssysteme der Virus-Lebenszyklus unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen; Bis vor kurzem sind solche Systeme entweder einzelne Aspekte des Virus-Lebenszyklus, oder eine einzige Infektionszyklus beschränkt. Tetracistronic Minigenome, die von Ebola-Virus nicht-kodierenden Regionen, ein Reporter-Gen bestehen, und drei Ebola-Virus-Gene in der Morphogenese beteiligt, angehende und Eintrag (VP40, GP 1,2 und VP24), kann die Replikation und Transkription verwendet werden -competent Virus-ähnliche Partikel (trVLPs), die diese Minigenome. Diese trVLPs kontinuierlich infizieren Zellen, die das EbolaVirusproteine ​​für die Genom Replikation und Transkription, so dass wir sicher modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen verantwortlich. Wichtig ist, dass die viralen Komponenten dieser Systeme ausschließlich durch Ebola-Virus stammt und nicht von anderen Viren (wie zum Beispiel in Systemen mit pseudotypisierten Viren der Fall ist), und VP40, VP24 und GP 1,2 sind in diesem System überexprimiert , wodurch es ideal für die Untersuchung der Morphogenese und angehEintrag, obwohl auch andere Aspekte des Virus-Lebenszyklus, wie Genom-Replikation und-Transkription kann auch mit diesem System modelliert werden. Daher ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren zur Verfügung und hat ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren in Zukunft. Hier stellen wir Informationen über die Nutzung des Systems, sowie die erwarteten Ergebnisse.

Transfektion von 293-Zellen mit Produzent Expressionsplasmide das Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30 und L, ein tetracistronic Minigenom und die Zubehör T7-Polymerase Ergebnisse in Minigenom-Replikation und-Transkription und-Reporteraktivität, die leicht bei 72 h (Abbildung 6 nachweisbar ist kodiert ). Wichtig ist, dass die beobachtete Reporteraktivität (10 5.6 relativen Lumineszenz-Einheiten (RLU)) größer als die einer Negativkontrolle, in der das Expressionsplasmid Codierung L wurde aus der Transfektion (10 3 RLU) um mehr als 2 log weggelassen. Das niedrige Niveau der Aktivität auch in Abwesenheit von L beobachtet wird, ist aufgrund einer kryptischen Promotor in der Minigenom-Plasmid am wahrscheinlichsten. Zielzellen mit trVLPs aus dem Überstand von Erzeugerzellen infiziert tatsächlich zeigen etwas erhöhte Reporteraktivität im Vergleich zu den Produktionszellen und Werte erreichen zwischen 10 6 und 10 7 RLU, abhängig von dem Durchgang. Im Gegensatz dazu wHenne der Überstand der L Steuerproduzentenzellen auf Zielzellen passagiert (alle Nukleokapsid-Protein exprimieren, einschließlich L), hat die Reporteraktivität nicht das Hintergrundrauschen des Luminometer (ca. 10 2 RLU) überschreiten. Die tetracistronic trVLP Test kann verwendet werden, um den Lebenszyklus von Ebola-Viren zu untersuchen. Zum Beispiel ist die Infektion von 293-Zellen mit trVLPs abhängig von der Anwesenheit der Bindung von Faktoren wie Tim-1-16, die in trans in diesen Zellen vorgesehen werden muss. Folglich wird in einem tetracistronic trVLP Assay ein Tropfen auf die Reporteraktivität in Zielzellen von etwa 100-fach in Abwesenheit von Tim-1 (7A) beobachtet. Die Rolle von spezifischen (virale oder zelluläre) Proteine ​​im Viruslebenszyklus kann auch mit RNAi-Technologie zusammen mit diesem Ansatz bewertet werden. Als Beispiel Herunterregulierung der L Ergebnisse RNAi-vermittelte in einem Rückgang der Reporter-Aktivität von etwa 100-fache, was auf die zentrale Rolle von LReplikation und Transkription (7B) 7. Ferner ist es möglich, das Minigenom, um die Wirkung der Mutationen auf die Virus-Lebenszyklus zu bewerten direkt zu manipulieren. Als Beispiel, wenn VP24-Expression aus dem Minigenom erfolgt mit 3 Stopp-Codons unmittelbar hinter dem Start-Codon abgeschafft, Reporteraktivität in Produzentenzellen ist nicht dramatisch verändert; Jedoch ist die Reporteraktivität in den Zielzellen um etwa das 20-fache nach einem Durchgang und 400-fach nach zwei Durchgängen reduziert, was auf eine Rolle von VP24 in der Produktion von infektiösen trVLPs (7C) 15. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Struktur des Ebola-Virus-Genom sowie monocistronischen und tetracistronic Minigenome. Kodierenden Regionen für das Ebola-Virus-Protein als rot dargestellt (NP,VP35, VP30 und L), Gelb (VP40 und VP24) oder blau (GP 1,2) Boxen. Nicht-kodierenden Regionen (NCR) sind grün markiert, mit dem Führer und Anhänger Regionen angezeigt. Der Index gibt an, welche Virus NCR wurde für die Verbindung der kodierenden Regionen verwendet. Die kodierende Region für die Reporter (rep) in lila dargestellt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. monocistronischen Minigenom-Assay. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​(NP, VP35, VP30, L), ein monocistronischen Minigenom (mg) und der T7-Polymerase transfiziert. Die Minigenom wird zunächst von der T7-Polymerase (a) in eine unencapsidated Minigenom-RNA in der gleichen Orientierung wie das virale Genom (vRNA), die dann von NP (b) eingekapselt transkribiert. Diese eingekapselt vRNA wird über einen komplementären RNA-Minigenom repliziert (cRNA) Zwischenprediate (c), und dann in Reporter-mRNAs (d), die in Reporterprotein (e) übersetzt werden transkribiert. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. trVLP Assay mit einem monocistronischen Minigenom. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Minigenom Assay-Komponenten (das Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​NP, VP35, VP30, L, ein monocistronischen Minigenom und die T7-Polymerase) sowie VP40, GP 1 transfiziert , 2 und VP24. Dies führt zu der Bildung von trVLPs die Minigenom haltigen Nukleokapsiden (F) aufzunehmen. Diese können dann trVLPs infizieren Zielzellen (g), die entweder mit Expressionsplasmiden für NP, VP35, VP30 und L (oben) pretransfected werden, was bei der Replikation und sekundäre Transkription (d), was zu Reporter-Expression (e) oder naiv Zielzellen (unten), wodurch die Transkription der primären minigenomes (h), auch Reporter-Expression (e) führt. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. trVLP Assay mit einem tetracistronic Minigenom. Zellen werden mit Expressionsplasmiden für die Ebola-Virus Nukleokapsidproteine ​​(NP, VP35, VP30, L), ein tetracistronic Minigenom (mg) und der T7-Polymerase transfiziert. Start der Transkription (a), die Verkapselung (b), Genomreplikation (c) und Transkription (d) sowie der Übersetzung (e) wie in einem monocistronischen Minigenom-Test auftreten. (F) jedoch neben Reporter-mRNA, mRNA für VP40, VP24 GP 1,2 und werden auch aus der tetracistronic Minigenom transkribiert wird, was zur Bildung von trVLPs. Diese trVLPs infizieren Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid-Proteine ​​NP, VP35, VP30 und L sowie der zellulären Ebola Virus pretransfected wurdenAnheftungsfaktor Tim-1, was zu einer Genom-Replikation und-Transkription und die Produktion von trVLPs, die verwendet werden können, um neue Zielzellen zu infizieren. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5 Zeitsteuerung eines tetracistronic trVLP Assay für 3 aufeinanderfolgende Passagen. Die Tage der Aussaat Zellen (en), Transfektion von Zellen (t), Infizieren von Zellen (i), Mediumwechsel (c) und Ernten von Zellen und trVLPs (h) für drei aufeinanderfolgende Durchgänge angegeben (durch Pfeile angedeutet). <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Typische Konzentrationen in einem tetracistronic trVLP Assay beobachtet Reporteraktivität. Ein tetracistronic trVLP Assay wurde über 5 Passagen nach der Protoc durchgeführtol in diesem Manuskript beschrieben. Als Negativkontrolle wurde das Expressionsplasmid Codierung L wurde (L) von der Transfektion der p0 Erzeugerzellen weggelassen. Zielzellen in den Durchgängen P1 bis P5 wurden mit Expressionsplasmiden für alle Nucleocapsid-Proteine, einschließlich L. Das Hintergrundrauschen des Luminometers ist als gestrichelte Linie angegeben transfiziert. Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 biologischen Replikaten von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt. <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Die Beurteilung der Auswirkungen verschiedener viraler und zellulärer Faktoren auf die viralen Lebenszyklus mit tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 als eine Anlage Faktor. Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden, kodierend für die Nukleokapsid-Proteine ​​mit oder ohne Plasmid kodierend für Tim-1 (15) beschrieben wurden, wurden mit pretransfected tet infiziertracistronic trVLPs. 72 Stunden nach der Infektion Reporteraktivität in p1 Zielzellen bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 biologischen Replikaten von 4 unabhängigen Experimenten sind. (B) Effekt von RNAi-Knockdown von L auf Genom-Replikation und Transkription Zielzellen, die mit Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid Komponenten pretransfected wurden, Tim-1 und miRNAs gegen gerichtet gezeigt. L (Anti-L) oder ein nicht verwandtes Protein (anti-GFP) (in 15 beschrieben) wurden mit tetracistronic trVLPs infiziert. 72 Stunden nach der Infektion Reporteraktivität in p1 Zielzellen bestimmt. Mittelwerte und Standardabweichungen von 5 biologischen Replikaten von 2 unabhängigen Experimenten sind in der Minigenom auf trVLP Infektiosität gezeigt. (C) Effekt von Mutationen. Ein tetracistronic trVLP Test wurde durchgeführt, entweder mit einem Wildtyp-Minigenom (4cis-WT) oder ein Minigenom in die 3 Stopcodons hatte unmittelbar nach dem Start-Codon des VP24 eingeführt worden ist, zur Aufhebung exprimieren of dieses Protein aber Einführen nur minimale Änderungen an der Minigenom in Bezug auf Länge, Nukleinsäurezusammensetzung, Sekundärstrukturen usw. Reporteraktivität in P0, P1 und P2 wurde 72 h nach der Transfektion / Infektion gemessen. Mittelwert und Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten von 3 unabhängigen Experimenten gezeigt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> Produzenten-Zellen (P0) </td><td style="width:180px;"> Zielzellen (P1 und höher) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = &quot;19&quot; style = &quot;height: 19px;&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-RLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-Tim1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. DNA zur Transfektion beträgt. Die Menge jedes Plasmid für die Transfektion von Produzenten und Zielzellen erforderlich ist, in ng pro Well einer 6-Well-Platte dargestellt. Alle Plasmide werden in Watt et al 15 beschrieben.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes at JoVE.com

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt. Tetracistronic Minigenom-haltigen Replikation und Transkription kompetenten virusähnlichen Partikeln (trVLPs) stellen eine Lebenszyklus-Modellierungssystem, das uns sicher zu modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, die sich ausschließlich auf Ebola-Virus-Komponenten ermöglicht.

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K Aufrufe.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt. Tetracistronic Minigenom-haltigen Replikation und Transkription kompetenten virusähnlichen Partikeln (trVLPs) stellen eine Lebenszyklus-Modellierungssystem, das uns sicher zu modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, die sich ausschließlich auf Ebola-Virus-Komponenten ermöglicht. 

Serie: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 1. Biosafety Level 4 Anzug Labor Suite Einreise- und Ausreiseverfahren

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...