Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIAID (R01AI074951, U54AI057168) und der Penn Genome Frontiers Institut SC unterstützt; von NIH T32HG000046 zu TSM; von NIH T32GM07229 und T32AI007324 zu LRS.

Teil 1: RNAi in 384 Well Platten <ol><li> Standardisierung der Reagenzien für das Screening verwendet unerlässlich. Wir testen einzelne Lose von Schneider Medien, Rinderfötenserum und Färbereagenzien. Dann haben wir Aliquot und verwenden die gleiche Menge für den gesamten Bildschirm. </li><li> Für jeden Test wird es am besten, verschiedene Zelllinien zu bestimmen, welche ist am wirkungsvollsten zu Ihrem biologischen read-out-Test. Wir verwenden in der Regel die S2-DRSC Linie. </li><li> Wachsen Drosophila-Zellen bei 25 ° C in völliger Schneider Medien. <ol class="lalpha"><li> Schneider Medien </li><li> 10% hitzeinaktiviertem FBS </li><li> 1X L-Glutamin </li><li> 1X Pen / Strep Antibiotika </li></ol></li><li> Drosophila-Zellen sind semi-Anhänger und sind ohne Trypsinierung passagiert alle vier Tage mit einer Pipette die Zellen aus dem Fläschchen und Verdünnen der Zellen 1.10 in eine frische Flasche. Die Zellen sind in Log-Phase für Experimente sein. </li><li> Plate-to-Plate-und Tag-zu-Tag Variabilität durch den Einsatz von automatisierten Liquid-Handling für alle flüssigen Zusätze zu Multi-Well-Platten minimiert. Wir verwenden eine WellMate (Matrix). </li><li> Bereiten WellMate Schlauch. <ol class="lalpha"><li> Sprayhood und WellMate mit 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Schläuche aus der Verpackung und Spray mit 70% Ethanol. </li><li> Das Rohr Kassette in Abgabeposition auf dem WellMate. </li><li> Prime Tubing mit 25 ml 70% Ethanol. </li><li> Sterilisieren Schlauch in Ethanol für 15 Minuten, dann grundieren mit weiteren 25 ml Ethanol. </li><li> Spülen Schlauch durch Grundierung mit 50 ml sterilem PBS. </li></ol></li><li> Verdrängen Zellen aus Kolben und zählen. Pellet-Zellen so, dass Sie 25% mehr als nötig (300xg, 5 min). Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung ausgesät muss nach Assay Länge optimiert werden. Bei der Durchführung von automatisierten Bildanalyse, ist eine einzige Monolage ohne Zelle Verklumpung ideal für Bildsegmentierung. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in serum-freien Schneider Medien 1.7x10 6 Zellen / ml. </li><li> Wir führen den Bildschirm in 384-Well-Platten mit einem kommerziell erhältlichen Bibliothek von dsRNA in einer Konzentration von 250ng/well pre-aliquotiert. Mehrere Brunnen jeder Platte sind leer für die Kontrollen, die manuell hinzugefügt wurden. Wir verwenden dsRNA Luciferase als negative Kontrolle. Wir verwenden dsRNA gegen Thread (DIAP) als Kontrolle für robuste RNAi. Knock down dieses anti-apoptotischen Faktor ergibt sich in dramatischen Zelltod und ist eine schnelle visuelle Weg, um die Qualität der knock down beurteilen. Schließlich verwenden wir eine dsRNA gegen das virale Reporter, in diesem Fall beta-Galactosidase, als positive Kontrolle, um zu überprüfen, dass wir Virusinfektion mit unserem Test Auslesen zu verhindern. Wenn Spotting dsRNA in Platte zum Zeitpunkt der Zellaussaat, Aliquot 1 ul dsRNA in die Ecke des Brunnens, um eine einfachere Visualisierung zu ermöglichen, dann Zentrifuge dsRNA auf Boden gut (300xg, 1 min) vor der Zugabe Zellen. </li><li> Verwenden Sie WellMate bis 10 ul Zellen über jeweils gut vorbereitet hinzuzufügen. </li><li> Spin-Zellen auf Platten durch Zentrifugieren 300xg, 1 min. </li><li> Inkubieren in 25 ° C Inkubator für 45 Minuten. </li><li> Add 20 uL komplette Schneider Medien-und Zentrifuge 300xg, 1 min. </li><li> Legen Platten in feuchter Tupperware Behälter ausgekleidet mit Wasser getränkten Papiertüchern. Das Volumen einer 384-Well ist klein, und so, Verdunstung kann große Auswirkungen auf die Biologie, die wiederum zu artifactual Veränderungen in der read-outs der Kante Brunnen führen können. Um dies zu überwinden, sollten Platten unter hoher Luftfeuchtigkeit gehalten werden. </li><li> Inkubieren für drei Tage bis zur robusten knockdown ermöglichen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Medien ändern, oder öffnen Sie befeuchteten Behälter während dieser Zeit. </li></ol> Teil 2: Infektion mit Vaccinia Virus <ol><li> Sterilisieren Multi-Channel-Aspirator in Quatricide für 15 Minuten, dann in 70% Ethanol spülen. </li><li> Bereiten WellMate wie oben beschrieben. </li><li> Bereiten Schneider Medien mit 2% FBS für eine Infektion durch Verdünnen komplette Medien 1:5 in serumfreien Medien. </li><li> Filter Rohöl Virus Lager bis 0,8 um Spritzenfilter um Zelltrümmer zu entfernen oder gereinigte Virus. </li><li> Verdünnen Vaccinia-Virus in 2% Serum Schneider Medien Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 erhalten. </li><li> Entfernen PBS aus WellMate Schlauch, Grundanstrich mit verdünnten Virus bis der Schlauch frei von Luftblasen. </li><li> Gebrauch sterilisiert Multi-Channel-Aspirator und Vakuumkammer zu entfernen sanft Medien von den Platten der dsRNA behandelten Drosophila-Zellen. </li><li> Dispense 30 ul Virus pro Well auf Platten mit dem WellMate. </li><li> Centrifuge Platten 1 Minute bei 300xg. </li><li> Sterilisieren WellMate Schlauch. Prime mit 25 ml 10% Bleach 10 Minuten warten, Grundanstrich mit weiteren 25 mL 10% Bleichmittel. </li><li> Prime Schläuche mit 50 ml Wasser, gefolgt von 50 ml 70% Ethanol. Zurück Schlauch an der Verpackung. </li><li> Zurück Platten befeuchtet Tupperware Behälter. Inkubation bei 25 ° C für 48 Stunden. </li></ol> Teil 3: Färbung Plates <ol><li> Fix Platten in 15 ul 4% Formaldehyd / PBS für 10 Minuten. Die Flüssigkeit wird entfernt mit einem Multi-Channel-Aspirator und Vakuumkammer bei jedem Schritt. Sobald Platten wurden behoben, sterile Geräte und Reagenzien sind nicht mehr notwendig. </li><li> Entfernen Sie fix und verwenden WellMate zu 30 ul PBST (PBS + 0,1% Triton-X) hinzu. Inkubieren 10 Minuten und wiederholen. Operate WellMate wie oben beschrieben, außer Schlauch muss nicht sterilisiert werden. </li><li> Zum Nachweis von Vaccinia-Infektion verwenden wir ein β-Galactosidase-Reporter von einem frühen / späten Vaccinia-Promotor angetrieben. </li><li> Nehmen Sie Flüssigkeit und inkubieren Zellen in Block (PBST mit 2% BSA) für 10 Minuten. </li><li> Verdünnen primärer Antikörper in Block, flüssiges und fügen 15 ul Antikörper in jede Vertiefung mit einem Multi-Channel wiederholen Pipette (Matrix). </li><li> Spin down-Platten (300xg, 1 min), mit einem klaren Aufkleber decken und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Entfernen primärer Antikörper, und verwenden Sie die WellMate, um Brunnen in PBST 3 mal, jeweils 10 Minuten abwaschen. </li><li> Verdünnen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (FITC) und Kernfärbung in Block und fügen Sie 15 ul in die Vertiefungen mit einer Multi-Channel wiederholen Pipette. </li><li> Die Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. </li><li> Wash Brunnen in PBST 3 mal, jeweils 10 Minuten mit dem WellMate. </li><li> Seal Platte mit klaren Aufkleber, Abdeckung, und lagern bei 4 ° C bis zu drei Wochen. </li></ol> Teil 4: Imaging and Image Analysis <ol><li> Verwenden Sie ein automatisiertes Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung auf Bild-Platten. </li><li> Machen Sie Bilder von insgesamt Kerne (DAPI) und infizierte Zellen (FITC). Optimieren Belichtungszeit für jeden Kanal individuell um Dynamikbereich zu maximieren. </li><li> Feinabstimmung der automatischen Fokus-Funktion, indem sie Z-Stapel von Bildern, Abstand 1um auseinander, dass die Flugzeuge span oberhalb und unterhalb der erwarteten Fokusebene. Sobald die optimale Fokusebene befindet, passen Autofokus-Einstellungen entsprechend an. </li><li> Bild die gesamte Platte, die Erfassung von mindestens drei Bildern pro Vertiefung sowohl in der Hoechst-Kanal (DAPI) und das Virus Kanal (FITC). Wählen Sie Websites aus verschiedenen Regionen innerhalb eines gut um Bilder, die gut vertreten als Ganzes zu erfassen. </li><li> Verwenden Sie MetaXpress Software, um eine Zeitschrift zu segmentieren schreiben Sie das Image und die Verwendung Count Kerne Module, um die Gesamtzahl der Zellen positiv für die Kernfärbung (insgesamt Zellen) und Infektionen (FITC) für jede Platte zu berechnen. </li><li> Berechnen Prozent Infektion (100 * FITC positive / insgesamt Zellen) und log zu verwandeln. </li><li> Zur Identifizierung Kandidaten, die wir verwenden eine robuste Z berechnet sich aus dem Median und Quartilsabstand jeder Platte basiert. Diese Methode ist unempfindlich gegenüber Ausreißern und unsymmetrischen Daten, und sorgt so für mehr Leistung bei der Identifizierung auch schwacher oder mäßiger hits 10. Für jede Platte ist der Median aus den Log-transformierten Daten subtrahiert. Dann werden die so ermittelten Werte werden um 0,74 fachen Quartilsabstand (die Differenz zwischen den Werten der 75-Perzentil und das 25-Perzentil) unterteilt. Die 0,74-Faktor ist die Angleichung einer Standard-Normalverteilung verwendet. </li><li> Die robuste Z-Score ist ein Maß für die Entfernung in Standardabweichungen vom Mittelwert der Platte. Zum Beispiel zeigt eine robuste Z-Score von 2% der Infektion der gut ist ~ 2 Standardabweichungen von der Platte Median-oder p &lt;0,05. </li><li> Analysieren Zellzahl auf zytotoxische Kandidaten zu identifizieren. Berechnen Sie die robuste Z-Scores der Kernenergie zählt. Kandidaten mit einem robusten Z &lt;-2 in doppelte Bildschirme gelten als zytotoxisch. </li><li> Wells, die eine robuste Z-Scores für die Prozent-Infektion von&gt; 2 oder &lt;-2 in doppelte Bildschirme (p &lt;0,0025) haben, ohne Zytotoxizität gelten als potenzielle Kandidaten aus dem primären Bildschirm. </li><li> Positive Kandidaten werden validiert durch unabhängige Reagenzien. dsRNAs gegen die Gene von Interesse aus einer anderen Region der mRNA generiert und getestet, wie oben. </li><li> Die Gene für die zwei unabhängigen dsRNAs haben die gleiche Phänotyp kann für weitere Untersuchungen in Betracht gezogen werden. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Bilder und Interpretation der Infektionsraten <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Infizierte Brunnen zeigen keine Färbung für Vaccinia-Virus-Proteine, während ein Vertreter infiziert und enthält Zellen Färbung für Vaccinia-Ausdruck beta-Galaktosidase (&amp;bgr; Gal)-Protein, wie Immunfluoreszenzmikroskopie gemessen positiv.Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Automatische Bildanalyse-Software quantifiziert Infektion in jedem Bild mit Hilfe von Parametern durch den Benutzer festgelegt. In einer repräsentativen Bildes sind die Gesamtzahl der Zellkerne und die Anzahl der Zellen, die Virus-Antigen auf Größe und die Intensität der Färbung über den lokalen Hintergrundfärbung gezählt. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Knockdown des Fadens (DIAP) dient als positive Kontrolle für robuste RNAi Depletion von Zielgenen. Knockdown dieser anti-apoptotischen Faktors führt zu dramatischen Zelltod. Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Knockdown Luciferase dient als negative Kontrolle für die Wirkung von doppelsträngigen RNA-Behandlung bei Infektion. Depletion von Luciferase hat keinen Einfluss auf Infektionen bezogen auf Zellen unbehandelt. Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Knockdown von &amp;bgr; Gal-Protein dient als positive Kontrolle für eine Verringerung der Infektion, da die Assay verwendet &amp;bgr; Gal-Protein-Spiegel als Auslesen der Infektion. Depletion von &amp;bgr; Gal führt zu einer Abnahme des Anteils der infizierten Zellen. Virus = grün, Zellkerne = blau. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Knockdown von zellulären Faktor Rab5 führt zu einer Abnahme des Anteils der infizierten Zellen. Da Rab5 ist bekannt, dass in der Endozytose beteiligt, dieser Faktor trägt wahrscheinlich zur Vaccinia-Virus-Eintrag. Dies stellt ein Beispiel Ausreißer aus dem Bildschirm. Virus = grün, Zellkerne = blau.

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	<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells.">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li><li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response.">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li><li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells:+regulation+of+viral+transcription+and+replication.">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li><li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors.">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells:+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions?.">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?.</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li><li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication.">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition.">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li><li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics.">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li></ol>

Genomweiten RNAi-Screening in Drosophila bietet eine robuste und effiziente Methode für die Untersuchung der zellulären Komponente der Virusinfektion. Eine Reihe von Säugetieren infizieren Drosophila-Zellen, die verwendet werden, um Komponenten des Host intrinsische Immunantwort und Wirtsprotein Faktoren für die virale Replikation, dass neue therapeutische Targets darstellen kann erforderlich identifiziert werden können. Vor der Durchführung eines Bildschirms, muss der Test sorgfältig Zelltyp, Zellzahl und Befall optimiert werden, und muss gut kontrolliert werden, die sowohl positive als auch negative virale und zelluläre Angriffspunkte 11. Es ist wichtig, um eine ausreichende Trennung zwischen positiven und negativen Kontrollen vor dem Screening zu gewährleisten, um den Dynamikbereich des Tests zu maximieren. Sobald der Bildschirm durchgeführt wurde, können die Kandidaten in funktionale Kategorien eingeteilt werden, um festzustellen, welche Host-Mechanismen der Infektion beitragen. Für Säugetiere Viren wie Vaccinia, sollte der Beitrag von Säugetier-Homologe von RNAi als Teil der sekundären Analyse bestimmt werden. Zusammen genommen werden diese robusten Screening-Methoden ermöglichen es uns, Einblicke in komplexe Mechanismen, durch die Viren interagieren mit ihren Wirtszellen zu gewinnen.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

Virale Erreger stellen eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, nicht nur Viren verursachen Epidemien von Krankheiten, aber ihre mögliche Verwendung in Bioterrorismus ist auch ein Anliegen. Ein besseres Verständnis der zellulären Faktoren, die Auswirkungen Infektion wäre die Entwicklung von dringend benötigten Therapien zu erleichtern. Jüngste Fortschritte in der RNA-Interferenz (RNAi)-Technologie mit vollständiger Sequenzierung des Genoms von mehreren Organismen gekoppelt ist, um die Optimierung der genomweiten, zellbasierte loss-of-function-Bildschirme geführt. Drosophila-Zellen sind besonders zugänglich genomweite Bildschirme wegen der Benutzerfreundlichkeit und Effizienz von RNAi in diesem System 1. Wichtig ist, dass eine Vielzahl von Viren infizieren Drosophila-Zellen, darunter eine Reihe von Säugetier-Viren der medizinischen und landwirtschaftlichen Bedeutung 2,3,4. Vorherige RNAi-Screens in Drosophila haben Host-Faktoren, die für die verschiedenen Schritte in Virus-Infektion, einschließlich Ein-, Übersetzungs-und RNA-Replikation 5 erforderlich sind identifiziert. Darüber hinaus sind viele der zellulären Faktoren für die virale Replikation in Drosophila Zellkultur benötigt auch die Begrenzung in menschlichen Zellen mit diesen Viren 4,6,7,8, 9 infiziert. Daher stellt die Identifizierung von Host-Faktoren während der viralen Infektion kooptiert neue Targets für eine antivirale Therapie. Hier präsentieren wir eine verallgemeinerte Protokoll für ein High-throughput RNAi Bildschirm, um zelluläre Faktoren in Virusinfektion beteiligt sind, mit Vaccinia-Virus als ein Beispiel.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel Wirtsfaktoren in Virusinfektion beteiligt durch zell-basierte genomweite Verlust der Funktion RNAi-Screening identifiziert werden. A<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellkultur-Modell ist besonders zugänglich, diesen Ansatz durch die Leichtigkeit und Effizienz von RNAi. Hier zeigen wir diese Technik mit<em&gt; Vaccinia</em&gt; Virus als ein Beispiel.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

9.4K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Novel Wirtsfaktoren in Virusinfektion beteiligt durch zell-basierte genomweite Verlust der Funktion RNAi-Screening identifiziert werden. A Drosophila Zellkultur-Modell ist besonders zugänglich, diesen Ansatz durch die Leichtigkeit und Effizienz von RNAi. Hier zeigen wir diese Technik mit Vaccinia Virus als ein Beispiel.

Serie: RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Forschung

Immunologie und Infektion

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...