Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 DK077195 bis R.M.A, R01 DK104641 bis R.M.A und D.R.B) unterstützt. Wir würdigen wertvolle Beiträge von Dr. Stuart Orkin in der Abteilung für Hämatologie/Onkologie, boston Children es Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School und dem Dana-Farber Cancer Institute. Wir würdigen auch die Unterstützung von Kyle Costa bei der postoperativen Pflege von Mäusen, Mary Taglienti und Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children es Hospital, Harvard Medical School) für technische Hilfe und hilfreiche Diskussionen.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility.">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24 (2013).</li><li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway.">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction.">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li><li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats.">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases.">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li><li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice.">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I:+architecture,+development+and+disease.">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II:+regenerative+applications.">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Das hier beschriebene Modell für die Verletzung des Rückenmarks der Maus bietet eine reproduzierbare Methode, um eine funktionelle Blasenauslassverstopfung aufgrund des Koordinationsverlusts zwischen Blasenkontraktion und externer Harnröhren-Schließmuskelentspannung zu schaffen. Dies wiederum erinnert an eine tiefgreifende Umgestaltung der Blasenwand bereits 2 Wochen nach einer Verletzung, die durch die Ausdehnung der urotheliale und glatten Muskelabteilungen gekennzeichnet ist. Kritische Schritte bei der Umsetzung des SCI-Modells bei Nagetieren sind (i) die strenge Aufmerksamkeit für die manuelle Blasenexpression während der Zeit des Wirbelsäulenschocks, die sich für 10 bis 201214 Tage nach der Verletzung ergibt; ii) anreichern, um den Gewichtsverlust zu minimieren; und (iii) Abschwächung des Potenzials für Urinverbrühungen insbesondere für Experimente, die über die Rückkehr der Reflexvoidelung hinausgehen. Zu den Einschränkungen des Modells gehören das Potenzial für Harnröhrenverschluss bei Mäusen aus Blutgerinnseln während der Zeit der transienten Hämaturie und zusätzlich bei männlichen Mäusen aus Semen koagulum nach retrograde Ejakulation nach der Operation.
Der hier beschriebene Ansatz der Gewebedissoziation veranschaulicht, wie wichtig es ist, strukturelle Veränderungen in Geweben zu berücksichtigen, die sich aus der experimentellen Beleidigung ergeben, in diesem Fall eine signifikante Gewebeumgestaltung nach GG, die nachgelagerte Analysen beeinflussen kann. Mit der Zunahme der Einzelzellanalysen ist es entscheidend sicherzustellen, dass die in der Genexpression beobachteten Unterschiede nicht einfach das Ergebnis dissoziationsinduzierter Störungen sind, sondern wirklich repräsentativ für die zugrunde liegenden biologischen Veränderungen sind, die für das Krankheitsmodell relevant sind. Die Verwendung öffentlich verfügbarer Expressionsdaten ermöglichte es uns, die Formulierung von Verdauungspuffern zu modifizieren, um eine effektive Verdauung der extrazellulären Matrix zu gewährleisten und gleichzeitig die Lebensfähigkeit zu maximieren. Weitere Modifikationen, die in zukünftigen Anwendungen in Betracht gezogen werden könnten, umfassen die Hinzufügung von Actinomycin D, um die Transkription von unmittelbaren frühen Genen zu stoppen, die empfindlich auf das Dissoziationsprotokoll15reagieren.
Pipettiertechnik ist entscheidend, wenn Gewebe getrennt oder Zellen übertragen werden, die sich bereits in Suspension befinden. Um die physische Schädigung von Zellen durch Scherkräfte zu reduzieren, ist es wichtig, während der Zellresuspension sanft und langsam Pipette zu pipette. Es wird generell empfohlen, Breitbohrpipettenspitzen zu verwenden. Bei Verwendung von Standardspitzen ist es besonders wichtig, Zellsuspensionen vorsichtig zu pipetteisieren, um Scherkräfte zu vermeiden, die sonst Zellen schädigen würden. Die Verwendung von Zellsieben ist in diesem Protokoll unvermeidbar, jedoch kann die Zellkonzentration um 20 % oder mehr sinken, begleitet von einem Volumenverlust von 100 l oder mehr. Wir empfehlen, die Zellkonzentration nach der Belastung zu bestimmen, um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten.
In der Durchflusszytometrie liefern FMO-Kontrollen ein Maß für den Hintergrund aufgrund von Signaldurchblutungen durch überlappende Emissionsspitzen. Sie sind kein Maß für unspezifische Antikörperbindung oder Hintergrundfärbung, die vorhanden sein kann, wenn ein Antikörper in diesem Kanal enthalten ist. Um die unspezifische Antikörperbindung zu berücksichtigen, muss man geeignete Isotypkontrollen einschließen; für die Hintergrundfärbung muss man negative Kontrollen einschließen. Zusammengenommen gewährleisten diese Kontrollen eine genaue Messung der Zellpopulationen.

Störungen der normalen Harnblasenfunktion können für viele Menschen zu einer verminderten Lebensqualität führen. Um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie Verletzungen oder Krankheiten die normale Blasenfunktion entgleisen lassen, ist es wichtig, den normalen biologischen Zustand der Zellen in der Blase zu untersuchen und zu untersuchen, wie sie sich unter experimenteller Störung verändern. Bis heute sind jedoch die spezifischen Zellpopulationen, die sich in der Harnblase befinden, und wie sie sich mit Verletzungen verändern, unvollständig charakterisiert.
Einzelzell-Profilierungsmethoden wie Durchflusszytometrie oder einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben das Potenzial, Licht auf bestimmte Zelltypen innerhalb der Blase zu werfen. Damit diese Ansätze jedoch informatives Gewebe sind, muss es so verdaut werden, dass die Lebensfähigkeit, die Genexpression und die repräsentativen Prozentsätze der Zellpopulation des geernteten Gewebes nicht beeinträchtigt werden. Protokolle, die enzymatische Disaggregation verwenden, können die Oberflächenmarkerexpression durch wahllose Proteaseaktivität1beeinflussen und dadurch die Zellidentifikation durch Durchflusszytometrie beeinflussen, während der Dissoziationsprozess selbst zur Induktion sofortiger früher Gene führen kann, wie kürzlich von Van den Brink und Kollegen2beschrieben. Die Autoren zeigten, dass die von der Dissoziation betroffene Subpopulation zwar gering war, aber aufgrund der hohen Expressionskonzentrationen der unmittelbaren frühen Gene ein starkes Kontaminierungssignal in Massenexpressionsstudien auslösen könnte. Darüber hinaus wirkte sich die Dauer des Dissoziationsprotokolls auf die nachgewiesenen Massenexpressionsniveaus von Genen aus, die für einige Subpopulationen eindeutig waren. Daher können Einzelzell-Datasets, die ohne Berücksichtigung der Auswirkungen des Dissoziationsprotokolls generiert werden, zu Veränderungen der Genexpression führen, die sich aus der Dissoziationsmethode ergeben, im Gegensatz zur zugrunde liegenden Biologie. Diese Beobachtungen legen nahe, dass veröffentlichte Einzelzell-Transkriptomikdaten mit Vorsicht interpretiert werden sollten und dass die Ergebnisse mit unabhängigen Methoden validiert werden sollten.
Obwohl, harte und langwierige Dissoziationsmethoden können genexpression in Zellenändern 2; eine effektive Isolierung der Zellen ist unerlässlich, um eine genaue Darstellung der vorhandenen Zelltypen zu erhalten. Da die Blase ein komplexes Organ ist, das mehrere Zelltypen umfasst, können einige Populationen wie urotheliale oder stromale Zellen relativ unterrepräsentiert sein, während andere Zelltypen wie Fibroblasten innerhalb der extrazellulären Matrix existieren und eine Herausforderung darstellen können, um zu isolieren. Die Dissoziation wird noch schwieriger, wenn die Blase eine signifikante Umgestaltung und Fibrose durchlaufen hat, wie sie bei Rückenmarksverletzungen3,4 oder Blasenauslassverstopfung 5,6beobachtet wurde.
Hier beschreiben wir eine optimierte Gewebedissoziationsmethode für die nachgeschaltete Einzelzellanalyse in der Rückenmarks-Verletzten-Mausblase. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie verglichen wir vier enzymatische Verdauungsprotokolle für ihre Fähigkeit, eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die Zelllebensfähigkeit zu unterstützen und den richtigen Anteil der Zellpopulationen aufrechtzuerhalten. Basierend auf dieser Analyse kommen wir zu dem Schluss, dass die Minimierung des Zelltodes, zellulärer Aggregate, nichtzellulärer Nukleinsäuren und potenzieller Inhibitoren nachgelagerter Analysen entscheidend für die Erreichung qualitativ hochwertiger Daten ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

Wir beschreiben die Umsetzung von Rückenmarksverletzungen bei Mäusen, um Detrusor-Sphincter-Dyssynergie, eine funktionelle Blasenauslassverstopfung und anschließende Blasenwandumbau zu entlocken. Um die Beurteilung der zellulären Zusammensetzung der Blasenwand bei nicht verletzten Kontroll- und Rückenmarks-verletzten Mäusen zu erleichtern, haben wir ein optimiertes Dissoziationsprotokoll entwickelt, das eine hohe Zelllebensfähigkeit unterstützt und die Detektion diskreter Subpopulationen durch Durchflusszytometrie ermöglicht.
Rückenmarksverletzungen entstehen durch vollständige Transsektion des Brustrückenmarks. Zum Zeitpunkt der Gewebeernte wird das Tier unter tiefer Anästhesie mit phosphatgepufferter Kochsäure durchsetzt und Blasen in Tyrodes Puffer geerntet. Gewebe werden vor der Inkubation im Verdauungspuffer gehackt, der basierend auf dem Kollagengehalt der Mausblase optimiert wurde, wie durch das Verhören öffentlich zugänglicher Genexpressionsdatenbanken bestimmt. Nach der Erzeugung einer einzelzelligen Suspension wird das Material durch Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit, der Zellzahl und spezifischer Subpopulationen analysiert. Wir zeigen, dass die Methode Zellpopulationen mit mehr als 90% Lebensfähigkeit und einer robusten Darstellung von Zellen mesenchymaler und epithelialem Ursprungs ergibt. Diese Methode ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse diskreter Zelltypen in der Mausblase und möglicherweise anderen Organen.

Chirurgischer Eingriff Der Erfolg der thorakalen Rückenmarkstransektion wird durch die Bewertung einer Reihe von Parametern bestimmt, von denen der offensichtlichste die Hinterbleibslähmung ist. Das Tier bewegt sich nur mit seinen Vorderbeinen und zieht seine Hinterbeine. Ansonsten sind Aktivitätsniveaus, einschließlich Fütterung, Pflege und Wachsamkeit, in der Regel normal. Darüber hinaus verlieren die Tiere die volitionale Blasenkontrolle, was dazu führt, dass der Prüfer alle 12 Stunden eine manuelle Blasenexpression benötigt, bis die Reflexenkundung nach 10 bis 14 Tagen nach der Verletzung zurückkehrt. Nach der Euthanasie beziehen sich weitere Anzeichen für den Erfolg der Verletzung in erster Linie auf die Erhöhung des Blasen-Körper-Gewichtsverhältnisses, was auf eine Umgestaltung des Gewebes hindeutet. Die histologische Analyse zeigt Hyperplasie sowohl innerhalb der urotheliale als auch der glatten Muskelabteilungen3.
Vorbereitung der einzelzelligen Suspension Anhand öffentlich zugänglicher Expressionsdaten wurde die Anreicherung von Blasengewebe für extrazelluläre Matrixproteine bestimmt (Abbildung 2) und zur Information der Formulierung des Verdauungsmixes verwendet. Da Kollagene Schlüsselkomponenten der Blasenwand11,12sind, haben wir zunächst versucht, die am häufigsten vorkommenden Kollagene in der Mausblase mithilfe von RNA-Profiling-Datensätzen zu bestimmen, die vom Mouse ENCODE-Projekt13generiert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass Kollagen 1A1, Kollagen 3A1, Kollagen 1A2 und Kollagen 6A1 am häufigsten Kollagentypen innerhalb der Mausblase sind (Abbildung 2A). Wir verwendeten auch das Tabula Muris (ein Kompendium von einzelzelligen Transkriptomdaten aus der Maus (Mus musculus))8, um den mRNA-Expressionsgrad von Kollagenen 1, 3, 6 und Hyaluronan zu bestimmen. Die Daten ermöglichen einen direkten und kontrollierten Vergleich der Genexpression in Zelltypen, die zwischen Geweben geteilt werden. Diese Analyse ergab, dass die Expression dieser extrazellulären Matrixkomponenten bei den mesenchymalen Zelltypen häufiger ist als in Urothelium (Abbildung 2B).
Wirkung der Dissoziation auf die Lebensfähigkeit isolierter Zellen aus der Blase Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass die enzymatische Verdauung mit den 4 verschiedenen Protokollen eine Lebensfähigkeit von 83 %, 86 %, 93 % bzw. 90 % ergab. So wurde Protokollabschnitt 3 als am wertvollsten für die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit angesehen. Wir beobachteten auch, dass etwa 4% der Zellen nekrotisch waren (PI+/Annexin V-) (Abbildung 4A). Diese Beobachtungen unterstreichen die Effizienz des Verdauungsprotokolls und den sich daraus ergebenden Nutzen für die Zelllebensfähigkeit.
Auswirkungen der Rückenmarksverletzung auf verschiedene Zellpopulationen in der Blase Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der Gesamtzellzahl in Blasen von SCI-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Das Muster der Punktdiagramme, die aus SCI-Blasen gewonnen wurden, war auch etwas anders als die laufende Organumgestaltung aufgrund von Rückenmarksverletzungen(Abbildung 4B: erste Spalte). Im Vergleich zu Kontrollen zeigten die Blasen von SCI-Tieren einen signifikanten Anstieg der CD45-positiven Zellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Perfusionsvervollständigung mit aufgehellten Farbe der Leber. (A) Zeigt die Leberfarbe zu Beginn der Perfusion. (B) Zeigt die aufgehellte Leberfarbe am Ende der Perfusion. Die Maus in (A) hatte Rückenmarkstransektion zwei Wochen vor der Perfusion, was zu Blasenhypertrophie und ihrem Vorsprung aus dem Becken im Gegensatz zur Maus in (B) führte, die keine Rückenmarksverletzung hatte; in diesem Fall ist die Blase klein und im Becken versteckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Abbildung 2: Transkriptomische Expression von komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in der Mausblase. (A) Balkendiagramm von 43 verschiedenen Kollagentypen. Der Ausdruck wird durch Reads Per Kilobase von Transkripten, pro Million zugeordneter Lesevorgänge (RPKM) angegeben (Daten werden aus BioProject gesammelt: PRJNA66167)14. (B) Geigenplots der Genexpression in Zelltypen, die aus mikrofluidischer Tropfen-basierter 3'-End-Zählung in einem Pool von männlichen und weiblichen dissoziierten Harnblasenproben (männlich und weiblich) gewonnen werden. Die Zählungen wurden für jede Zelle mit dem natürlichen Logarithmus von 1+ Zählungen pro Million ln (CPM+1)8protokollnormalisiert. Vor der Einnahme von Logarithmen wurde eine Pseudoanzahl von 1 CPM hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Abbildung 3: Gating-Strategie und FMO-Kontrollen zur Bestimmung der Fluoreszenzausbreitung. (A) Auswahl der Zellpopulation. (B) Gating-Strategie für Singlets. (C) Gating für nekrotische und frühe und späte apoptotische Zellen mit PI- und Annexin-V-Antikörpern. (D-u2012F) Ein schematisches Punktdiagramm aus mehrfarbiger Durchflusszytometrie (z. B. Antikörper konjugiert mit A, B, C, D Fluorochromen + (Annexin V und PI). Dies zeigt die Fluoreszenz, die sich in den Antikörper mit Fluorchrom-A-Kanal ausbreitet, der von der FMO-Steuerung im Vergleich zu einer ungefärbten Kontrolle gezeigt wird. Orange gepunktete Linie stellt FMO-Gating-Grenze im Vergleich zu unbefleckten Grenze in rot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrie verschiedener Zelltypen in der Blase. (A) Anhang in V/PI Doppelfärbeflussdiagramme. Die verschiedenen Kombinationen von Enzymen und Chemikalien, die für jedes Protokoll verwendet werden, werden vor dem entsprechenden Lebensfähigkeitsdiagramm dargestellt. Diese Daten belegen die höchste Lebensfähigkeit, die mit Protokollabschnitt 3 ermittelt wurde. (B) Repräsentative Histogramme, die die Intensität von Ly-6A/E (Sca-1) und CD326 (Ep-CAM) veranschaulichen, die in einzelnen Kanälen nachgewiesen werden. (C) Wirkung von SCI auf die Zellpopulation der Mausblase. Obere Platte zeigt Ergebnisse der Färbung auf drei dissoziierten Blasen aus der Kontrolle nicht-chirurgische Mäuse und untere Panel zeigt die Ergebnisse der Färbung an drei Tieren mit SCI. Die erste Spalte ist die gesamte Zellpopulation. Die zweite Spalte zeigt die Singlet-Gating-Auswahl. Die dritte Spalte zeigt die Teilpopulation von lebenden Zellen, die für B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen negativ sind. Die vierte Spalte zeigt die Färbung für lebende Zellen positiv für CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Betrag (für 500 ml)</td>
			<td>Molarität</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Komponenten zur Vorbereitung der Tyrodes-Lösung. Die angegebenen Komponenten sind für die Vorbereitung von 500 ml Tyrodes Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Protokollabschnitt 1</td>
			<td>Protokollabschnitt 2</td>
			<td>Protokoll Abschnitt 3</td>
			<td>ProtokollAbschnitt 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ I</td>
			<td>132,5 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ III</td>
			<td>96,4 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ VI</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
			<td>115 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
			<td>10,5 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zelldissoziationslösung</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekombinantes Enzym</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Komponenten zur Herstellung des Verdauungspuffers. Die angegebenen Komponenten sind zur Herstellung von 2,5 ml Verdauungsmischung (1 U katalysiert die Hydrolyse von 1 mol pro Substrat pro Minute bei 37 °C. Siehe Produktdatenblatt für die Definition der Einheit jedes Enzyms).

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein optimiertes Gewebedissoziationsprotokoll auf ein Mausmodell der Rückenmarksverletzung anzuwenden und den Ansatz für die Einzelzellanalyse durch Durchflusszytometrie zu validieren.

Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K Aufrufe.  Boston Children's Hospital. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein optimiertes Gewebedissoziationsprotokoll auf ein Mausmodell der Rückenmarksverletzung anzuwenden und den Ansatz für die Einzelzellanalyse durch Durchflusszytometrie zu validieren.

Serie: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Forschung

Biologie

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Zystometrischen und externen urethralen Sphincter Messungen in wach Ratten mit implantierten Katheter und Elektroden für wiederholte Messungen

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Rückenmarkstransektion bei Xenopus laevis Kaulquappen

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Ein integrierter Ansatz zur Identifizierung und Sequenzanalyse von Mikroproteinen

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...