Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Fröschen. Das erworbene Wissen könnte neue Erkenntnisse liefern, um zu verstehen, wie Menschen auf Rückenmarksverletzungen reagieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Leichtigkeit bei der Durchführung der Verletzung, und auch, dass diese Technik im Vergleich zum Paradigma der Schwanzamputation besser nachahmt, was beim Menschen passiert.
Diese Technik ermöglicht es, den regenerativen Prozess herauszufordern, um die Beteiligung verschiedener Gene, Proteine, Moleküle und Signalwege besser zu verstehen und dadurch neue therapeutische Ziele zu identifizieren. In der Lage zu sein, diese Schritte zu sehen, ist entscheidend, um dieses Verfahren einfach und reproduzierbar zu machen. Drei bis vier Wochen nach der Befruchtung die Kaulquappen in eine Petrischale geben und die Morphologie und das Aussehen der Vorder- und Hintergliedmaßen überprüfen.
Achten Sie auf die folgenden anatomischen Merkmale von Tieren im Stadium 50, Vordergliedmassen, die gerade erscheinen und kugelförmig sind, und Hintergliedmaßen, die hervorstehen und kugelförmig sind. Anästhesieren Sie vor der Operation die Kaulquappen, indem Sie sie in 0,02% tricaine mesylat in 0,1-facher Barth-Lösung geben, und überprüfen Sie, ob die Tiere nicht reagieren, indem Sie sie auf den Kopf stellen. Um die Rückenmarkstransektionsoperation durchzuführen, verwenden Sie einen Esslöffel und eine Pinzette, um eine betäubte Kaulquappe-Rückenseite der Stufe 50 auf ein nasses Stück Gaze in der oberen Hälfte einer Glas-Petrischale zu legen.
Machen Sie dann mit einer Mikrodissektions-Federschere einen Schnitt der Haut und der Rückenmuskulatur auf der mittleren Thoraxebene. Achten Sie bei Kontrollscheintieren darauf, dass die Schnittgröße nur 0,2 Millimeter beträgt und das Rückenmark nicht schädigt. Machen Sie bei den transektierten Tieren einen zweiten Schnitt von 0,2 Millimetern, um das Rückenmark vollständig zu durchdringen.
Nach der Operation die Kaulquappen in einen Tank mit 500 Millilitern 0,1-facher Barth-Lösung mit einmaligem Penicillin und Streptomycin bei einer Dichte von 10 bis 12 Kaulquappen pro Tank geben. Pflegen Sie die Transekten und kontrollieren Sie Scheinkaulquappen in separaten Tanks. Halten Sie die Kaulquappen mit Belüftung bei einer Temperatur von 20 bis 21 Grad Celsius.
Wechseln Sie die Barth-Lösung mit Antibiotika jeden zweiten Tag bis zum Ende des Experiments. Beginnen Sie einen Tag nach der Operation mit der Fütterung der Kaulquappen und beseitigen Sie die toten Tiere. Für den Schwimmtest besorgen Sie sich eine Box mit LED-Beleuchtung von innen, die mit einer transparenten Polystyrolplatte bedeckt ist, durch die Licht durchgelassen werden kann, und installieren Sie eine Kamera über der LED-Box.
Legen Sie dann eine Petrischale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern auf die Box, die mit 100 Millilitern 0,1-facher Barth-Lösung gefüllt ist. Legen Sie eines Tages nach der Transsektion eine Kaulquappe in die Petrischale und lassen Sie sie für eine fünfminütige Anpassungsphase stehen. Starten Sie nach der Anpassung fünf Minuten lang die Videoverfolgung des Freischwimmverhaltens mit der Referenzsoftware.
Nachdem das Video abgeschlossen ist, übertragen Sie die Kaulquappe zurück in ihren Tank. Dieses repräsentative Punktdiagramm zeigt die Wiederherstellung der motorischen Funktion im Laufe der Zeit. Fünf Tage nach der Transsektion schwammen Kaulquappen durchschnittlich 0,7 Meter in fünf Minuten und zeigten eine reduzierte Schwimmkapazität.
Diese Kapazität nahm mit den Tagen zu und zeigte durchschnittlich 2,1 Meter in fünf Minuten nach 10 Tagen und 3,1 Meter in fünf Minuten nach 15 Tagen nach der Transsektion. Die vollständige Erholung der Schwimmkapazitäten wurde 20 Tage nach der Transsektion beobachtet, mit einem Durchschnitt von 5,7 Metern in fünf Minuten. Der Schwimmdurchschnitt kann je nach Tiercharge variieren.
Somit sollte die Versuchsgruppe immer mit den jeweiligen Kontrollen verglichen werden und nicht mit zuvor erhaltenen Daten. Nach der Operation können Tiere für globale Analysen verwendet werden, einschließlich Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik, und um nach Verbindungen zu suchen, die die Regeneration des Rückenmarks hemmen oder fördern, um neue therapeutische Ansätze zu entwickeln.
