Unsere Methode hilft, Genexpressionsdaten aus komplexen Geweben auf Einzelzellebene zu generieren und zu verstehen. Unsere Methode kann auf praktisch jedes Gewebe in gleicher Weise angewendet werden und führt zu qualitativ hochwertigen Daten mit sehr wenigen protokollbezogenen Artefakten. Dr. Janna Leiz und ich aus der Arbeitsgruppe Schmidt-Ott werden das Protokoll vorstellen.
Beginnen Sie damit, die Niere auf eine Kaltpräparierplatte zu legen und verwenden Sie ein scharfes Skalpell oder eine Rasierklinge, um eine mittlere Scheibe von ein bis zwei Millimetern zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebestück die gesamte kortikomedulläre Achse enthält. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere und eine Pinzette, um den Kortex vorsichtig von den Seiten des Mittelstücks abzuschneiden.
Innerhalb des präparierten Gewebestücks sollten die drei Segmente Kortex, äußere Medulla und innere Medulla deutlich sichtbar sein. Übertragen Sie das Nierenstück in die zuvor hergestellte RNA-Stabilisierungslösung und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Entfernen Sie nach 24 Stunden die RNA-Stabilisierungslösung.
Entfernen Sie die überschüssige Lösung vorsichtig mit einem Seidenpapier und lagern Sie das Taschentuch bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie das gefrorene Nierenstück und übertragen Sie es in eine 60 Millimeter große, vorgekühlte Polystyrol-Petrischale auf Eis, die einen Milliliter Nuclei Lysis Buffer 1 oder NLB1 enthält. Zerkleinern Sie die Taschentücher gründlich mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell.
Schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab und geben Sie das Hackfleisch und den Puffer in das auf Eis gelegte Mahlrohr. Stellen Sie sicher, dass alle Stücke übertragen wurden, und waschen Sie die Petrischale fünf- bis 10-mal mit dem Puffer. Bewegen Sie den Stößel A langsam 25 Mal im Mühlenrohr auf Eis auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.
Führen Sie das Homogenisat durch ein 100-Mikrometer-Sieb in einem vorgekühlten 15-Milliliter-Auffangrohr auf Eis und waschen Sie den Filter mit einem weiteren Milliliter NLB1. Waschen Sie das Mahlröhrchen mit kaltem EZ-Kernlysepuffer und entsorgen Sie den Puffer. Übertragen Sie das Homogenisat zurück in das Mahlrohr und bewegen Sie den Stößel B langsam 15 Mal im Mahlrohr auf Eis auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.
Übertragen Sie das Homogenisat in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Sammelrohr auf Eis. Waschen Sie das Mühlenröhrchen mit weiteren zwei Millilitern NLB1 und stellen Sie sicher, dass alle Gewebefragmente in das Sammelröhrchen übertragen werden. Inkubieren Sie das Homogenat fünf Minuten lang auf Eis, um die Zellen zu lysieren.
Das Homogenisat wird durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Auffangrohr geleitet. Schleudern Sie das Sammelröhrchen fünf Minuten lang bei 500 mal G bei vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit einem Schwenkeimerrotor. Fügen Sie in der Zwischenzeit RNase-Inhibitorlösung zu NLB2 hinzu.
Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in vier Millilitern NLB2. Legen Sie die Aufhängung vorsichtig mit einem Ein-Milliliter-Kissen aus Saccharose-Gradientenpuffer unter.
Schleudern Sie die Suspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit einem Schaufelrotor auf 500 mal G. In der Zwischenzeit RNase-Inhibitorlösung in den Suspensionspuffer der Kerne geben. Entfernen Sie das Auffangröhrchen nach dem Zentrifugieren vorsichtig aus der Zentrifuge und achten Sie darauf, die beiden Schichten beim Umgang mit dem Auffangröhrchen nicht zu stören.
Die Zelltrümmer können zwischen den beiden Schichten beobachtet werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, beginnend mit den Trümmern. Entfernen Sie den verbleibenden Überstand, ohne das Kernpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Kernsuspensionspuffer.
Das Homogenat wird durch ein 20-Mikrometer-Sieb in das vorgekühlte, fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen mit einem Fassungsvermögen von fünf Millilitern geleitet. Die Anzahl der Gene wurde gegen die Anzahl der Transkripte aufgetragen, die durch eindeutige molekulare Identifikatoren definiert und durch den Anteil der mitochondrialen Reads gefärbt wurden, um die Qualität der isolierten Kerne zu beurteilen. Insgesamt wurden 20.000 Gene in 6.000 Kernen mit 1.600 Mediangenen und 2.800 Median-Identifikatoren pro Zellkern nachgewiesen.
Genexpressionsmuster von Cluster-angereicherten Markern wurden mit Hilfe eines Punktdiagramms und Zelltyp-Clustern in einem t-verteilten stochastischen Nachbar-Embedding-Diagramm visualisiert. Der Prozentsatz jedes Zelltyps wurde berechnet und verwendet, um das Verhältnis von proximalen Tubuluszellen zu dicken aufsteigenden Gliedmaßenzellen zu bestimmen. Es ist wichtig, jederzeit bei vier Grad Celsius zu arbeiten und in Probeläufen die optimale Gewebemenge zu bestimmen, um qualitativ hochwertige Suspensionen und optimale Konzentrationen zu gewährleisten.
