In dieser Studie verwendeten wir Bat MHC Class I als Modell, um die Methodik zusammenzufassen und die Machbarkeit einer hybriden MHC-Klasse zu bewerten, die mit heterologem Beta-2-Mikroglobulin komplexiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass die B2M-Substitution des Säugetiers die Peptiddarstellung nicht signifikant beeinflusst. Tatsächlich kann die hybride MHC-Klasse I eine ähnliche Struktur und Funktion wie das ursprüngliche Molekül aktivieren.
Diese Techniken können verwendet werden, um die funktionelle und strukturierte Untersuchung von MHC I für die Gewebereaktionsbewertung während der Infektionskrankheit und Tumorimmuntherapie zu erleichtern. Für die E.coli-Kulturtransformation fügen Sie 10 Nanogramm Plasmid, das Fledermäuse oder menschliche MHC-Klasse I enthält, beta zwei Mikroglobulin-Wasserstoffkette zu 100 Mikroliter nequalisierte Suspension und baden die Suspension in Eis für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation schockieren Die Hitze die Bakterien 90 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius und bringen die Kultur für zwei Minuten ins Eisbad zurück.
Als nächstes fügen Sie 800 Mikroliter Lysogeny Brühe in die Kultur, und schütteln Sie die Suspension auf einer Schaukelplattform für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, und 200 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter der Bakterien auf eine geeignete antibiotikaresistente Kulturklinge verteilen. Am nächsten Morgen wählen Sie einen einzigen kürzlich transformierten bakteriellen Klon und impfen Sie den Klon mit drei Millilitern LB mit Antibiotikum.
Stellen Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius auf die Schaukelplattform. Am nächsten Morgen 500 Mikroliter des aktivierten Bakterienbestandes in 50 Milliliter LB mit Antibiotikum übertragen und die Bakterien über Nacht in den Schaukelbrutkasten zurückbringen. Teilen Sie den verbleibenden aktivierten Bakterienbestand in 500 Mikroliter Aliquots auf und fügen Sie jedes Aliquot zu 500 Mikroliter Volumen von 40% Glycerin hinzu, für eine Speicherung von minus 80 Grad Celsius.
Um große Mengen an rekombinantem Protein zu erzeugen, übertragen Sie am nächsten Morgen die bakterielle Suspension in zwei Liter LB mit Antibiotikum im Verhältnis eins bis 100 und geben Sie die Kultur in den Schaukelbrutkasten zurück, bis eine Absorption von 0,6 bei 600 Nanometern erreicht ist. Fügen Sie dann eine Millimolar IPTG zur Kultur hinzu, um die Expression des Transgens zu induzieren. Nach vier bis sechs Stunden Induktion die Bakterienkultur zur Zentrifugation auf Flaschen übertragen und die bakteriellen Zellpellets in 60 Milliliter PBS pro Flasche wieder aufhängen.
Befreien Sie dann das exprimierte rekombinante Protein durch Ultraschallzellstörer 99 Mal, für sechs Sekunden und ein Intervall von 12 Sekunden bei 300 Watt pro Beschallung. Zur Inklusionskörperreinigung die beschallten Bakterien durch Zentrifugation sammeln und die Pellets in einem geeigneten Waschpuffer volumen für zwei zusätzliche Zentrifugationen wieder aufhängen. Nach der zweiten Wäsche die Einschlusskörper und den Wiedersuspensionspuffer erneut aussetzen und einen 20-Mikroliter-Aliquot der Probe für die SDS-Seite beiseite legen, um die Reinheit des Inklusionskörpers zu testen.
Zentrifugieren Sie die verbleibende Probe und wiegen Sie den einschlusskörper, der Pellet enthält. Fügen Sie den Pellets auflösungspuffer zu einer Endkonzentration von 30 Milligramm Inklusionskörper pro Milliliter Puffer hinzu. Und verwenden Sie einen magnetischen Rührer, um die Lösung langsam bei vier Grad Celsius zu rühren, bis sich die Einschlusskörper im Auflösungspuffer auflösen.
Nach dem Wegwerfen der Ausfällungen die Einschlusskörper bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius lagern. Für MHC-Komplex-Umfalten, fügen Sie eine fünf Millimolar reduziert Glutathion und 0,5 Millimolar oxidierteGlutathion bei 250 bis 300 Milliliter, ein vier Grad Celsius Umfaltungspuffer. Und rühren Sie die Lösung langsam auf einem Magnetrührer bei vier Grad Celsius für 10 bis 20 Minuten.
Für MHC Wasserstoffkette und Beta zwei Mikroglobulin Verdünnung, laden Sie den Einschlusskörper in eine Ein-Milliliter-Spritze und injizieren sie das gesamte ein Milliliter Volumen der Inklusionskörperlösung in einen Liter Umfaltungspuffer in der Nähe der Rührstange, um eine schnelle und effiziente Verdünnung zu erhalten. Als nächstes fünf Milligramm pro Milliliter Peptid in Dimethylsulfoxid auflösen und schnell 200 Mikroliter Peptid in die Umfaltlösung injizieren, wie gerade gezeigt. Nach 10 bis 20 Minuten langsamen Rührens drei Milliliter H-Ketten-Einschlusskörper in ein neues Einliter-Volumen des Umfaltpuffers injizieren und die Umfaltung bei vier Grad Celsius für acht bis zehn Stunden ermöglichen.
Zur Bestimmung der neu gefalteten Proteinkonzentration geben Sie einer Druckkammer mit einer 10 Kilodalton Multi-Kupfer-Oxidase-Membran einen Austauschpuffer hinzu und konzentrieren den Puffer auf 30 bis 50 Milliliter Volumen. Übertragen Sie die Umfaltlösung auf ein Zentrifugenrohr, und entfernen Sie die Ausscheidungen durch Zentrifugation. Übertragen Sie das Supernate vorsichtig in die Kammer und konzentrieren Sie den Puffer weiter auf ein Endvolumen von etwa einem Milliliter.
Entfernen Sie alle endgültigen Verunreinigungen durch Zentrifugation und übertragen Sie das Supernate in ein steriles Rohr. Verwenden Sie eine dreihundert GL-Maximale Ausschlussspalte, um die Proteine zu reinigen, die Proben in der Spitze zu sammeln und sie mithilfe der SDS-Seite zu analysieren. Sammeln Sie den MHC-Komplex Peak und konzentrieren Sie das Protein auf eine Endkonzentration von 15 Milligramm pro Milliliter.
Dann verdünnen Sie den Komplex auf 7,5 Milligramm pro Milliliter Konzentration. Um die Kristallisation des komplexen MHC und Peptids mit der Sitting Drop Vapor Diffusionstechnik durchzuführen, fügen Sie 0,8 Mikroliter der Probe auf eine kommerzielle Kristallplatte und versiegeln Sie die Platine. Gleichgewichten Sie die Probenlösung gegen 100 Mikroliter Reservoirlösung bei vier oder 18 Grad Celsius, und verwenden Sie ein Mikroskop, um das Kristallwachstum in den nächsten sechs Monaten regelmäßig zu beobachten.
Zum kryogenen Schutz übertragen Sie die Kristalle am Ende des Experiments in eine Speicherlösung, die 20 % Glycerin enthält, bevor Sie die Proben in einem 100 Grad Kelvin gasförmigen Stickstoffstrom schnell abkühlen. Dann sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten nach Standardprotokollen. Um die Struktur der Kristallkomplexe zu bestimmen, öffnen Sie die hochauflösenden strukturellen Röntgenbeugungsdaten im Denzo-Programm innerhalb des SOFTWAREpakets HK L 2000, und wählen Sie ein erstes Modell in der Proteindatenbank aus.
Um die Struktur des Proteins zu bestimmen, öffnen Sie die Daten im Phaser MR-Programm in CCP4 und verwenden Sie das verfeinerte Röntgenmodell für die anfängliche Gelenkverfeinerung. Verwenden Sie dann die Phoenix-Verfeinerung allein und Gelenkmodi für die Röntgen-Alleinverfeinerung und das Gelenkneutron für die Röntgenverfeinerung. Überprüfen Sie nach jeder Verfeinerungsrunde das Modell manuell mit dem Fo-Fc und den 2Fo-Fc-Karten für die positive Kerndichte in Coot.
In diesen repräsentativen Experimenten wurden die Bindungskapazitäten des Hendra-Virus abgeleitet Hendra Virus One Peptid mHC Klasse I Wasserstoffketten mit homologe Fledermaus beta zwei Mikroglobulin und heterologe menschliche Beta zwei Mikroglobulin untersucht. In beiden Analysen wurden Kristalle mit hoher Auflösung durch Renaturierung mit der Beta-Zwei-Mikroglobulin-Lichtkette gebildet. In Ermangelung von Beta zwei Mikroglobulin, Diese Komplexe bilden sich nicht.
In der Wasserstoffkette Hendra Virus der MHC-Klasse I menschliche Beta zwei Mikroglobulin-Struktur, konservierte Rückstände H31, D53, W60, und Y63 des menschlichen Beta zwei Mikroglobulin, die Fledermaus Beta zwei Mikroglobulin entsprechen, nehmen Kontakt mit der Unterseite der Peptidbindung Nut und konserviert Q8, Y10, R12, und 24 Rückstände, die die Beta zwei Mikroglobuline an die Alpha-drei-Domäne gebunden entsprechen. In der Gesamtfledermaus und menschlichen Strukturen, die durchschnittliche Wurzel mittlere quadratische Ableitung von Rückständen ein bis 184 der Wasserstoffketten ist 0,248 unter allen Kohlenstoff-Alpha-Atom-Überlagerungen, was darauf hindeutet, dass es keine Unterschiede zwischen diesen beiden Komplexen. Die Struktur der Peptidausrichtung zeigt, dass die Bestätigungen des Hendra Virus ein Peptide in diesen beiden Komplexen ziemlich ähnlich sind.
Die Sequenzausrichtung zeigt auch, dass die Aminosäuren von Beta zwei Mikroglobulin aus verschiedenen Arten hochkonserviert sind. Es ist wichtig, den gegnerischen Komplexen eine hohe Reporting-Effizienz anzubieten. Daher ist es wichtig, geeignete stutziertes Beta-Mikroglobulin auszuwählen und hochgereinigte Einschlusskörper zu verwenden.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um stabile MTC I Komplex durch mögliche Beta zwei Mikroglobulin Substitutionen in anderen Arten zu erhalten, und zu existieren, sie sind MTC I Struktur und Funktion. Die aus diesen Studien gewonnenen Daten können verwendet werden, um T-Zell-Reaktionen während Infektionskrankheiten und Tumorimmuntherapien zu bewerten.
