Diese Arbeit wurde von der NIA R00 AG053412 (KEF) unterstützt.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health und nach den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of North Carolina im Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #19-020) genehmigt.
1. Vorbereitung auf die Kultur
HINWEIS: Diese Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem von Gewebekulturen bezeichneten Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Siehe Tabelle 1 für Medien und Lösungen.
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge durch Autoklavieren in selbstdichtenden Sterilisationsbeuteln.</li>
	<li>Bereiten Sie Arbeitsbestände an Poly-D-Lysin für die Behandlung von 12-Well-Kultur-Gerichte.<ol>
<li>Setzen Sie Poly-D-Lysin in 1x Boratpuffer auf und bis zu einer Konzentration von 100 g/ml (10x konzentriert). Ca. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern, bis es benötigt wird.</li>
		<li>10x konzentriertes Poly-D-Lysin in dPBS auf 10 g/ml (1x) verdünnen und filtersterilisieren.</li>
		<li>12-Well-Kulturplatten mit 0,5 ml pro Brunnen von 1x Poly-D-Lysin bei Raumtemperatur mindestens 1 h oder über Nacht für die Verwendung am nächsten Tag behandeln. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Poly-D-Lysin ausreicht, um den unteren Rand des Kulturbereichs vollständig abzudecken.</li>
		<li>Kurz vor der Verwendung Entfernen Sie Poly-D-Lysin von der Kulturplatte, spülen Sie 3x in sterilem Wasser und halten Sie in sterilem Wasser, bis sie bereit sind, Zellen zu verplatten. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch eine gründliche Aspiration vor der Beschichtung von Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Neuron Growth Media und FACS-Puffer vor. Filter sterilisieren und bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern. Neuron Growth Media kann für ca. 2 wks aufbewahrt werden; DER FACS-Puffer kann für ca. 4 wks aufbewahrt werden.</li>
</ol>2. Sezieren des embryonalen Hippocampus
HINWEIS: Dieses Verfahren kann auf der Tischplatte durchgeführt werden, da es die Verwendung eines Stereomikroskops zur Entfernung von Meningen und Mikrodissektion des Hippocampus erfordert. Halten Sie sich an die strenge aseptische Technik, um potenzielle Verunreinigungen zu minimieren.
<ol><li>Euthanisieren Sie eine zeitschwangere C57BL/6J weibliche Maus am embryonalen Tag 18 in einerCO2-Kammer.</li>
	<li>Die Bauchhaut und das Fell mit 70% EtOH besprühen, dann die Haut mit Gewebezangen kneifen und mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt machen. Das Peritoneum dazu neigen, die Eingeweide und die Gebärmutter freizulegen.</li>
	<li>Greifen Sie die Gebärmutter mit Standard-Musterzange, heben Sie aus der Höhle, und schneiden Sie die Verbindung zum Mesometrium mit feiner Schere. Gebärmutter mit Embryonen auf 100 mm sterile Kunststoffkulturschale auf Eis geben.</li>
	<li>Mit feiner Schere und feinen Zangen, schneiden Sie vorsichtig die Gebärmutter und entfernen Sie die embryonalen Säcke, um Embryonen freizusetzen. Übertragen Sie Embryonen auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit dPBS, die auf Eis gelegt wird.</li>
	<li>Enthaupten Sie embryonale Welpen mit einer feinen Schere und übertragen Sie Köpfe auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale, die Hibernate-E-Medium enthält, das auf Eis gelegt wird.</li>
	<li>Um das Gehirn zu entfernen, halten Sie den Kopf mit einem Paar feiner Zange in einer Hand. Mit gekrümmten Dumont #7 Zangen in der anderen Hand, legen Sie die Spitze der Zange an der Basis des Schädels und kneifen sie den Knochen und die überlagernde Haut, die sich an der Mittellinie bewegt, ohne das Gehirn zu durchdringen.</li>
	<li>Mit gekrümmten Zangen ziehen Sie die Haut und den Schädel auseinander, um das Gehirn zu belichten. Sweep die gekrümmten Zangen unter dem Gehirn von der exponierten Olfaktor-Lampe zum Kleinhirn, um das Gehirn aus dem Schädel zu heben. Übertragen Sie das Gehirn auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit Hibernate-E-Medium auf Eis gelegt. Wiederholen Sie dies für jedes Gehirn. HINWEIS: Alle Gehirne können in einem einzigen Kulturgericht gesammelt werden, es sei denn, es muss für experimentspezifische Zwecke getrennt werden.</li>
	<li>Unter einem Stereo-Sektionsmikroskop, das mit einem Gehirn nach dem anderen und zwei Paaren steriler Dumont-#5 Zangen arbeitet, olfaktorische Glühbirnen abkniffen und Hirngebungen wegziehen. Eine gründliche Entfernung der Meningen ist notwendig, um eine Kulturelle Kontamination durch andere Zellen zu vermeiden und eine weitere Zerlegung zu ermöglichen.</li>
	<li>Sobald Meningen richtig entfernt sind, öffnet sich die überlegene Seite des Kortex seitlich, wodurch der Hippocampus freilegt wird. Mit Dumont #5 Zangen, kneifen Sie den Hippocampus vom angeschlossenen Kortex weg und übertragen Sie isolierten Hippocampus vorsichtig auf ein steriles 15 ml konisches Rohr, das 5 ml Hibernate-E-Medium auf Eis enthält.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Sezieren für beide Gehirnhälften für jeden embryonalen Mauswelpen und kombinieren Sie alle Hippocampi zu einem einzigen 15 ml konischen Röhrchen, es sei denn, dies wird separat für experimentespezifische Zwecke benötigt.<ol>
<li>Um kortikale Neuronen zu kultur, kann der Kortex vom Subcortex getrennt und identisch mit Hippocampus-Neuronen verarbeitet werden. HINWEIS: An diesem Punkt kann das Protokoll angehalten werden. Speichern Sie Gehirne oder sezierte Hippocampi in Hibernate-E Medium ergänzt mit B27 (2%) bei 4 °C für bis zu 1 Monat, obwohl eine längere Verzögerung die Anzahl der lebensfähigen Zellen gefährden kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissoziierende und kultivierende Hippocampus-Neuronen
HINWEIS: Alle Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem als Biosicherheitsschrank bezeichneten Gewebekultur-Schrank durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie 0,5 ml Papain-Dissoziationslösung pro Embryo für hippocampale Dissoziation vor. Das benötigte Volumen der Dissoziationslösung hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden. HINWEIS: Für die kortikale Neuronenkultur 1,0 ml Papainlösung pro Embryo vorbereiten.<ol>
<li>Lösen Sie 20 l Papainsuspension pro 1 ml des Hibernate E Mediums durch Wirbeln für ca. 3 min auf.</li>
		<li>Nachdem Papain aufgelöst wurde, fügen Sie 1 l DNase I pro 1 ml der Lösung hinzu. Wirbeln Sie die Lösung nicht, nachdem DNase I hinzugefügt wurde, da dies das Enzym deaktivieren kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifuge 15 ml konische Röhre mit Hippocampusgewebe (Schritt 2.10) bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Papain-Lösung hinzu. Setzen Sie das Gewebe wieder aus, indem Sie es mehrmals umkehren. Bei 37 °C für 30 min inkubieren, um das Gewebe alle 10 min wieder aufzuhängen.<ol>
<li>Wenn Sie kortikale Neuronen kultivieren, übertragen Sie alle Kortiken auf eine neue 100 mm sterile Kulturschale, saugen Sie sorgfältig Medien von der Platte und Hackfleischgewebe mit feiner Schere oder Rasierklinge. Papain-Lösung in die Kulturschale geben und kortikales Gewebe mit Papainlösung mit einer sterilen Transferpipette in 15 ml konische Röhre übertragen. Gewebe- und Enzymlösung bei 37 °C für 30 min inkubieren und alle 10 min aufregen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während 30 min Inkubation, bereiten Sie 3 feuerpolierte Glas Pasteur Pipetten: 1 vollständig offen, 1 hälfte offen und 1 Viertel offen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach der 30 min Inkubation die 15 ml konische Röhre mit verdautem Hirngewebe bei 125 x g für 10 min. Entfernen Sie die Enzymlösung und ersetzen Sie sie durch ein gleiches Volumen an frischem Hibernate E Medium.</li>
	<li>Mit vollständig geöffneter Pasteurpipette das Gewebe 10x trituieren. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.</li>
	<li>Mit halb offener Pasteur Pipette, triturat Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension auf das gleiche 50 ml konische Rohr wie im vorherigen Schritt. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.</li>
	<li>Mit Viertel offen Pasteur Pipette, triturate Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen, dann übertragen Sie die überstande Zellsuspension wieder auf die gleiche 50 ml konisch wie in den vorherigen Schritten. Entsorgen Sie das verbleibende Gewebe, das sich nicht dissoziiert hat.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr, das den Überstand aus der Zellsuspension bei 125 x g für 5 min enthält. Wenn nicht bereits getan, waschen Sie poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit sterilem Wasser und entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch gründliche Aspiration während der Zentrifugation.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml Neuron Growth Media wieder aussetzen. Zählen Sie lebende Zellen mit Trypanblau und Hämozytometer.<ol>
<li>Wenn sie kortikale Neuronen kultivieren, fügen Sie mindestens 10 ml Neuron Growth Media für weniger dichte Zellen und genauere Zählung hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnung von Zellen mit Neuron Growth Media für eine endgültige Beschichtungsdichte von 5 x 105 lebensfähigen Zellen pro ml und fügen Sie 1 ml verdünnte Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu. Neuronen bei 37 °C mit 5%CO2erhalten. HINWEIS: Typischerweise ergeben die Hippocampi von 1 embryonalen Maushirn, d.h. 2 Hippocampi, etwa 1 x 106 lebensfähige Zellen. Diese Nummer wird nur für Experimentplanungszwecke bereitgestellt und sollte nicht als Ersatz für das Zählen von Zellen für jede Kultur betrachtet werden.</li>
	<li>Ändern Sie die Wachstumsmedien am Tag nach der Kultur, indem Sie die Hälfte des Medienvolumens aus jedem Brunnen entfernen, d. h. 0,5 ml, und fügen Sie eine gleiche Menge an frischen Medien zur Seite des Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass die kultivierten Zellen gestört werden. Komplette Halbmedienwechsel zweimal wöchentlich für die Lebensdauer der Kultur.</li>
</ol>4. Beurteilung der MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Bereiten Sie die Behandlung durch Verdünnung von Interferon beta (IFN) oder einem gleichen Volumen von Verdünnungsmittel in Neuron Growth Media vor. Da der Medienwechsel ein halbbänderischer Wechsel sein wird, bereiten Sie Behandlungsmedien mit 2x konzentriertem IFN- d.h. zur Behandlung von 3 Brunnen einer 12-Well-Platte mit 100 U/ml IFN, 1,5 ml mit 200 U/ml IFN oder gleicher Menge ifN-Verdünnungsmittel für medienbehandelte Kontrollen vorbereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie 0,5 ml aus jedem Brunnen der Neuronen und fügen Sie 0,5 ml Neuron Growth Media mit oder ohne IFN zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren unter normalen Wachstumsbedingungen (37 °C, 5% CO2) für 6-72 h, abhängig von experimentellen Bedingungen und Signaloptimierung.</li>
	<li>Nach der Behandlungszeit, entfernen Sie alle Kulturmedien und waschen Sie vorsichtig einmal in kalten neurobasalen Medien ohne Ergänzungen (B27, L-Glutamin, Pen-Strep).</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml nicht-supplementiertes kaltes neurobasales Medium hinzu, das 1 g/ml Fc-Block und 1 g/ml fluoreszierenden konjugierten Anti-MHCI-Antikörper enthält. Bei 4 °C 45 min vor Licht schützen.</li>
	<li>Entlegen Sie die antikörperhaltigen Medien und waschen Sie sie vorsichtig einmal in kaltem dPBS. Fügen Sie jedem Brunnen 0,5 ml enzymfreie Zelldissoziationspuffer mit Raumtemperatur hinzu und agitieren Sie, um Zellen zu vertreiben. Achten Sie auf die Dissoziation mit dem invertierten Gewebekulturmikroskop.</li>
	<li>Sobald zellen von der Kulturschale gelöst sind, fügen Sie 0,5 ml FACS-Puffer zu jedem Brunnen hinzu, trituieren Zellen, um Klumpen zu dispergieren, und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Brunnens auf einzelne 1,7 ml Mikrozentrifugenrohre.</li>
	<li>Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer wieder auf und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Rohres auf einzelne Brunnen einer 96-Well-U-Bodenplatte.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 100 l fixatives Reagenz hinzu. Trituieren Sie mehrmals, um zu vermeiden, dass Zellen verklumpen und 15 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 200 l FACS-Puffer wieder auf.</li>
	<li>Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das permeabilisierungsreagenz in 100 l an jedem Brunnen in 100 l an. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur vor Licht geschützt mit Schaukeln für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 100 L FACS-Puffer wieder auf. 2x wiederholen.</li>
	<li>Nach der Endwäsche die Zellen in 100 l mit 2% Paraformaldehyd, verdünnt im FACS-Puffer, wieder aussetzen. Mischen Sie gut, um zu verhindern, dass Zellen verklumpen. Bei 4 °C vor Licht geschützt bis zur Ablesung auf einem Durchflusszytometer lagern. Lesen Sie die Proben so schnell wie möglich, innerhalb von 1 Woche.</li>
</ol>5. Quantifizierung und Auswertung von Daten
<ol><li>Messen Sie die Kompensationskontrollen für jeden Fluoreszenzfarbstoff und korrigieren Sie alle Spektralüberlappungen. Ideale Kompensationskontrollen umfassen kultivierte Neuronen, die nicht gefärbt, nur mit Anti-MHCI gefärbt und nur mit Anti-NeuN gefärbt sind.</li>
	<li>Zeichnen Sie nach Möglichkeit 100.000 Ereignisse für jedes Beispiel auf (mindestens 10.000) und speichern Sie sie als FCS-Dateien.</li>
	<li>Um Daten mithilfe geeigneter Analysesoftware zu analysieren, richten Sie sequenzielle Gates ein, wie in Abbildung 1A-C dargestellt, um sie für NeuN-positive Neuronen auszuwählen.<ol>
<li>Plot SSC-A (log) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf die Zellpopulation (P1), um zelluläre Ablagerungen aus der Analyse zu entfernen.</li>
		<li>Innerhalb der Zellpopulation P1, Diagramm FSC-H (linear) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf der Einzelzellenpopulation.</li>
		<li>Innerhalb der Einzelzellpopulation, Plot SSC-A (log) vs NeuN (log). Zeichnen Sie ein Tor auf NeuN-positive Population mit ungefärbten oder MHCI-nur gefärbten Zellen als Leitfaden.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein Histogramm der MHCI-Fluoreszenz mit zellulären Ereignissen, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Zeichnen Sie ein horizontales Tor, um die prozentualen Neuronen positiv für MHCI zu quantifizieren.</li>
		<li>Exportieren Sie die Prozentzellen positiv für MHCI sowie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für MHCI auf die NeuN-positive Population zur statistischen Auswertung und grafischen Zeichnung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur der primären Hippocampus-Neuronen von pränatalen Mauswelpen am embryonalen Tag 18. Die Verwendung von primären Neuronen, die von Nagetieren kultiviert werden, ist eine der grundlegendsten Methoden, die in der modernen Neurobiologie entwickelt wurden22. Obwohl verewigte Zelllinien bestimmte Aspekte von Neuronen modellieren können, lässt ihre Natur als tumorabgeleitete Zellen, das Versagen, definierte Axone zu entwickeln, und die fortgesetzte Zellteilung Zweifel aufkommen, ob sie die Eigenschaften post-mitotischer Neuronen in vivo23originalgetreu rekapitulieren. Eine weitere Alternative zu primären Neuronen ist die Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs). Die Technologie für den Einsatz von HiPSCs, insbesondere solche, die von Patienten abgeleitet sind, hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt24. Allerdings gibt es immer noch Einschränkungen bei der Arbeit mit HiPSCs, einschließlich Variabilität zwischen Zelllinien, mangelnde funktionelle Reife und Unterschiede in epigenetischen Profilen25. Obwohl es auch Einschränkungen bei der Arbeit mit dem reduktionistischen Modell der primären Nagetier-Neuronen gibt, behalten kultivierte Neuronen die post-mitotische Natur von Neuronen in vivo. Außerdem bevorzugen die umfangreichen molekularbiologischen Werkzeuge und genetischen Modifikationen, die für Mäuse verfügbar sind, die Verwendung von primären Neuronen gegenüber HiPSCs für viele Anwendungen, und Mausstudien können leicht in den komplexeren In-vivo-Organismus übersetzt werden, ohne das experimentelle genetische System zu verlieren. Aus diesen Gründen, viele Forscher verwenden primäre Nagetier Neuronen, um Schlüsselaspekte zu überprüfen, wenn nicht die Masse, ihrer Forschung.
Für bestimmte Assays können Neuronen direkt nach der Isolierung aus dem Gehirn ex vivo analysiertwerden. Dies ist besonders wünschenswert für Experimente mit erwachsenen Mäusen, die bestimmten Versuchsbedingungen ausgesetzt sein können oder die von Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen abhängen können; Es gibt jedoch mehrere Probleme, die die Art der Analysen einschränken, die durchgeführt werden können. Es ist technisch schwierig, eine einzelzellige Suspension von Neuronen aus dem Gehirn von erwachsenen Mäusen vorzubereiten, weil Neuronen einzigartig miteinander verbunden sind und durch Myelin26verzahnt sind. Nicht-enzymatische Methoden der Gewebetrituration sind ineffizient bei der Dissoziierung des Gewebes und verursachen zelltodig, während enzymatische Präparate oft Zelloberflächenantigenespalten 27. Darüber hinaus, während Myelin ist weitgehend fehlt bei embryonalen Mäusen, Es umfasst etwa 20% des erwachsenen Gehirns, und kann lebensfähige Zellisolation beeinträchtigen und behindern Flusszytometrie-Analyse28. Viele der Techniken, die entwickelt wurden, entfernen schließlich Neuronen ihres Zytosols und hinterlassen kleine, abgerundete Zellkörper, die hauptsächlich aus Kernenbestehen 29. Obwohl dies für einige Analysen akzeptabel ist, ist dies nicht geeignet, um die zytoplasmatische oder extrazelluläre Proteinexpression zu quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht das reduktionistische Zellkultursystem das Testen spezifischer mechanistischer Fragen auf einer kürzeren Zeitskala, als dies häufig mit einem In-vivo-System möglich ist.
Ebenfalls in diesem Protokoll beschrieben sind Methoden zur pharmakologischen Stimulierung der MHCI-Expression mit IFN- und die Quantifizierung der extrazellulären MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie. Die Stimulation durch IFN ist eine nützliche positive Kontrolle zum Testen anderer experimenteller Bedingungen, aber es kann angemerkt werden, dass IFN und Kainsäure auch die MHCI-Expression in den Neuronen9,30stimulieren können, während Tetrodotoxin die MHCI-Expression14verringert. Frühere Methoden zum Nachweis der MHCI-Expression stützten sich auf In-situ-Hybridisierung und immunhistochemische Analyse14,15,20,31. Während mRNA-basierte Assays, wie In-situ-Hybridisierung und qRT-PCR, die raumzeitliche Lokalisation, die Zelltypspezifität und den Grad der Gentranskription bestimmen können, können diese Assays die Proteintranslation oder den Transport zur Plasmamembran nicht bewerten. Immunhistochemische und westliche Blot-Analysen können Unterschiede in der Proteinexpression und potenziell zellulären Lokalisation bestimmen, können aber schwierig zu quantifizieren sein. Darüber hinaus erkennen viele MHCI-Antikörper die tertiäre Struktur des Komplexes und sind hochempfindlich gegenüber konformen Veränderungen. Dadurch führen Permeabilisierungs- oder Denaturierungsbedingungen zum Verlust der MHCI-Immunreaktivität32. Die hier vorgestellte Methode verwendet In-situ-Immunostainierung für MHCI, die die Erkennung des Proteins durch den Antikörper in seiner nativen Konformation ermöglicht, gefolgt von Fixierungs- und Permeabilisierungsmethoden.
Mit leichten Modifikationen können die hier beschriebenen Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer extrazellulärer Proteine von Interesse zu bewerten. In diesem Protokoll sind einfache Modifikationen, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zu kulturieren, aber die hier beschriebenen Methoden können auch verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kulturieren, wie striatale Neuronen33. Obwohl dieses Protokoll die Immunfärbung von MHCI und NeuN festlegt, können andere zelluläre Marker in ähnlicher Weise identifiziert werden. Im Allgemeinen können extrazelluläre Marker wie MHCI und intrazelluläre Marker wie NeuN behandelt werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass während des zellulären Dissoziationsschritts axonale Projektionen vom Soma abgetrennt werden. Da die hier definierte Gating-Strategie zelluläre Trümmer abschirmt und sich auf den neuronalen Kernmarker NeuN konzentriert, können Proteine, die ausschließlich in axonalen Projektionen exprimiert werden, nicht nachgewiesen werden.
Bis vor kurzem, Neuronen wurden gedacht, um MHCI nur als Reaktion auf Schäden auszudrücken, Infektion, oder In-vitro-Zytokin-Stimulation, um zytotoxische CD8+ T-Zellen9zu engagieren. Neue Forschung hat eine weitere Funktion von MHCI bei der Regulierung synaptischer Verbindungen während der Entwicklung13aufgeklärt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet IFN, um die MHCI-Expression in Wildtyp-kultivierten Neuronen zu stimulieren, aber ähnliche Methoden können mit einer Vielzahl von zellulären Reizen oder genetischen Modifikationen verwendet werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Diese Methode wird es den Forschern ermöglichen, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die MHCI-Expression regulieren, was das Verständnis der dichotomen Rolle von MHCI auf diesen beiden unterschiedlichen zellulären Funktionen verbessern wird.

Das zentrale Nervensystem (ZNS) galt einst als frei von Immunüberwachung, genannt als "immunprivilegiert1". Es ist jetzt klar, dass dieses Privileg nicht gleichbedeutend mit dem absoluten Fehlen von Immunkomponenten ist, sondern mit einer speziellen Regelung, die funktioniert, um den Schaden im Zusammenhang mit der Immunpathologie zu begrenzen1. In der Tat, Kommunikation zwischen dem ZNS und dem Immunsystem ist ein laufendes Gespräch, das für eine gesunde Gehirnentwicklung und Reaktion auf Infektionen notwendig ist2,3.
Wichtige Histokompatibilitätskomplex-Moleküle der Klasse I (MHCI) sind polygene und polymorphe Transmembranproteine, die am besten für ihre Funktion bei der Darstellung antigener Peptide gegenüber CD8+ T-Zellen während der Infektion4bekannt sind. Klassische MHCI-Komplexe bestehen aus einer Transmembran-α-Kette und einer extrazellulären Lichterkette, der sogenannten 2-Mikroglobulin. Die α-Kette enthält eine polymorphe Nut, die ein antigenes Peptid für Diepräsentation5bindet. Die richtige Expression von MHCI auf der extrazellulären Membran erfordert eine koordinierte Wirkung molekularer Chaperonen am endoplasmatischen Retikulum, um eine ordnungsgemäße Faltung des α-Kette und des 2-Mikroglobulins zusammen mit der Belastung eines Hochaffinitätspeptidligands zu gewährleisten5. Erst wenn MHCI-Komplexe zusammengesetzt sind, werden sie aus dem endoplasmatischen Retikulum in die Plasmamembran6exportiert. Nach Der Einbindung des kogatierten T-Zellrezeptors mit dem Peptid-belasteten MHCI-Komplex vermitteln CD8+ T-Zellen die Zelltötung durch Freisetzung von lytischem Granulat, das Perforin und Granzyme enthält, oder durch Induktion von Apoptose durch Bindung des Fas-Rezeptors auf die Zielzellmembran7. Zusätzlich produzieren CD8+ T-Zellen Zytokine, wie Gamma-Interferon (IFN) und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF), die antivirale Mechanismen in infizierten Zellen ohne zytopathische Wirkungen aktivieren können8,9. Für viele neurotrope Viren sind CD8+ T-Zellen notwendig, um die Infektion von der ZNS10,11,12zu befreien.
Es wurde früher angenommen, dass Neuronen MHCI nur unter Bedingungen von Schäden, Virusinfektionen oder mit In-vitro-Zytokinstimulation ausdrücken. Kürzlich hat die Forschung eine Rolle für die neuronale Expression von MHCI bei synaptischen Remodeling und Plastizitätidentifiziert 13,14. Obwohl die genauen Mechanismen, die der Synapsenregulation zugrunde liegen, nicht gut verstanden werden, deuten die Daten darauf hin, dass der MHCI-Expressionsgrad durch die synaptische Aktivität15,16reguliert wird. Eine Hypothese geht davon aus, dass Neuronen gepaarte Immunglobulin-ähnliche RezeptorEn B (PirB) präsynaptisch ausdrücken, die MHCI transynaptisch13,17bindet. Diese Wechselwirkung initiiert eine Signalkaskade von PirB, die sich gegen Wege wendet, die an der synaptischen Umgestaltung beteiligt sind, wodurch die synaptische Verbindung17,18,19verstärkt und stabilisiert wird. In Ermangelung einer neuronalen Aktivität wird die MHCI-Expression um14verringert, und der Verlust von MHCI führt zu einer fehlerhaften Synapsenelimination und falsch organisierten synaptischen Schaltkreisen20,21.
Der hier beschriebene Assay, der von Chevalier et al.9adaptiert wurde, verwendet eine zytometrische Flussanalyse, um die extrazelluläre Proteinexpression von MHCI auf Primärkulturen muriner Hippocampus-Neuronen quantitativ zu bewerten. Dieses Protokoll veranschaulicht die ersten Techniken zur Mikrosezieren von Hippocampusgewebe aus embryonalen Mauswelpen. Es beschreibt dann Prozesse für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Gewebe in eine einzelzellige Suspension und Methoden zur Aufrechterhaltung der Kulturen in vitro. Weil sie sich nicht teilen, müssen Neuronen, sobald sie in der Kultur sind, in einer Schale und einer Dichte plattiert werden, die für ihren experimentellen Endpunkt geeignet ist. Als nächstes werden Schritte zur Induktion der MHCI-Expression mit Beta-Interferon (IFN), zur Immunkennzeichnung für MHCI und neuronalen Kernmarker NeuN und zur Analyse von Zellen durch Durchflusszytometrie beschrieben. Schließlich werden Verfahren zur Bewertung der Durchflusszytometriedaten zur Identifizierung von MHCI-positiven Neuronen und zur Quantifizierung des Niveaus der MHCI-Expression beschrieben. In diesem Protokoll sind auch kleine Anpassungen aufgeführt, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zusätzlich zu oder anstelle von Hippocampus-Neuronen zu kulturieren. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um spezifische Hypothesen mit genetischen Variationen oder pharmakologischen Behandlungen zu testen.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>100 mm sterile culture dish</td><td>Fisher</td><td>FB012924</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Genesee</td><td>21-103</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Genesee</td><td>21-108</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>FACS Buffer Reagent</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP82031Gal</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>96 well U-bottom plate</td><td>Genesee</td><td>25-221</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Borate Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>28341</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td><td>Fisher</td><td>13 678 20C</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer</td><td>Gibco</td><td>13 151 014</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo</td><td>90083</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td><td>Invitrogen</td><td>GAS003</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247601</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td><td>Fisher</td><td>181254</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr><tr><td>Interferon Beta</td><td>PBL Assay Science</td><td>12405-1</td><td>Flow Cytometry Supplies</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td><td>MilliporeSigma</td><td>FCMAB317PE</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td><td>BioLegend</td><td>116513</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Papain Solution</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>Dissociation Solution Reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td>Neuron Culture Reagent</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Stereo dissection microscope</td><td>Swift</td><td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-10</td><td>Dissection Tool</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Corning</td><td>357575</td><td>Laboratory Supplies</td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>101319</td><td>Flow Cytometry Antibody</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-100ML</td><td>Tissue Culture Supplies</td></tr></tbody></table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

Zunehmende Beweise stützen die Hypothese, dass neuroimmune Wechselwirkungen die Funktion des Nervensystems sowohl bei homöostatischen als auch bei pathologischen Bedingungen beeinflussen. Eine gut untersuchte Funktion der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I (MHCI) ist die Darstellung von zellabgeleiteten Peptiden für das adaptive Immunsystem, insbesondere als Reaktion auf Infektionen. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Expression von MHCI-Molekülen auf Neuronen aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Konnektivität während der normalen Entwicklung und neurologischen Störungen modulieren kann. Die Bedeutung dieser Funktionen für die Gesundheit des Gehirns unterstützt die Notwendigkeit eines empfindlichen Assays, der die MHCI-Expression auf Neuronen leicht erkennt. Hier beschreiben wir eine Methode zur primärer Kultur der murinen Hippocampus-Neuronen und anschließend die Bewertung der MHCI-Expression durch zytometrische Flussanalyse. Der murinische Hippocampus wird am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen mikroseziert. Gewebe wird mit enzymatischen und mechanischen Techniken in eine einzelzellige Suspension zerlegt und dann in einem serumfreien Medium kultiviert, das das Wachstum nicht-neuronaler Zellen begrenzt. Nach 7 Tagen in vitro wird die MHCI-Expression durch pharmakologisch eiternde Behandlung kultivierter Zellen mit Beta-Interferon stimuliert. MHCI-Moleküle werden in situ mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, dann werden Zellen nicht enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert. Um die neuronale Identität zu bestätigen, werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, permeabilisiert und mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, der das neuronale Kernantigen NeuN erkennt. Die MHCI-Expression wird dann durch zytometrische Flussanalyse auf Neuronen quantifiziert. Neuronale Kulturen können leicht durch genetische Modifikationen oder pharmakologische Interventionen manipuliert werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Mit leichten Modifikationen können diese Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer Proteine von Interesse zu bewerten.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurde Hippocampusgewebe am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen seziert. Das Gewebe wurde mit enzymatischen und mechanischen Methoden in eine einzellige Suspension zerlegt und dann in 12 Brunnenplatten kultiviert, die mit Poly-D-Lysin vorbehandelt wurden. Nach 7 Tagen in vitro wurden die Zellen mit 100 U/ml IFN oder Medien nur für 72 h behandelt, was die Expression von MHCI stimulierte. Neuronen wurden in situ für MHCI gefärbt, bevor sie nicht-enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert wurden. Neuronen wurden fixiert und permeabilisiert, dann intrazellulär für neuronale Kerne Marker NeuN gefärbt. Die Proben wurden mittels Durchflusszytometrie bewertet und die Daten wurden mit zugehöriger Software analysiert. Neuronen wurden durch sequenzielle Gating der Gesamtereignisse identifiziert, um zelluläre Ablagerungen und Doublets auszuschließen (Abbildung 1A,B). Neuronen wurden definitiv durch NeuN-Positivität identifiziert (Abbildung 1C). NeuN+ Zellen wurden weiter auf MHCI-Positivität analysiert, indem Zellen auf einem Histogramm mit der Anzahl der Zellen, die in den Modus auf der y-Achse normalisiert wurden, und MHCI-Fluoreszenz auf der x-Achse dargestellt wurden. Ein MHCI+ Gate wurde an dem Punkt gezeichnet, an dem positive und negative Spitzen auseinandergingen (Abbildung 1D). Daraus werden die prozentualen Neuronen positiv für die MHCI-Färbung (Abbildung 1E) und die mediane Fluoreszenzintensität (MFI; Abbildung 1F) berechnet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die IFN-Behandlung den Anteil der Neuronen positiv für die extrazelluläre Färbung von MHCI sowie den Grad der Expression, wie durch MFI angegeben, signifikant erhöht hat. Statistische Auswertungen und grafische Darstellungen wurden mit kommerziell verfügbarer statistischer Software durchgeführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie und MHCI-Quantifizierung. Primäre Hippocampus-Neuronen wurden nur mit 100 U/ml IFN oder Medien behandelt. Nach 72 h wurden Neuronen extrazellulär mit pacific Blue-conjuged MHCI (1 g/mL H2-Kb)gefärbt, dann intrazellulär mit PE-konjugiertem NeuN (1:100 Verdünnung) gekennzeichnet. Die zelluläre Fluoreszenz wurde durch Durchflusszytometrie und Daten analysiert. (A) Gesamtereignisse wurden als SSC-A (log) vs FSC-A (linear) und Zellen (P1) geziert, um Trümmer auszuschließen. (B) Innerhalb der P1-Population wurden Zellen als FSC-H (linear) vs FSC-A (linear) dargestellt, um die Einzelzellpopulation zu bevölkern. (C) Innerhalb der Einzelzellpopulation wurden Zellen SSC-A (log) vs NeuN-PE (log) geplottet. NeuN+ Zellen wurden abgezäut, um Neuronen zu identifizieren. (D) Innerhalb der Neuronenpopulation wurden Zellen auf einem Histogramm mit MHCI-PacBlu auf der x-Achse und Zellzahlen dargestellt, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Ein horizontales Tor wurde gezogen, um den Prozentsatz der Neuronen positiv für MHCI Färbung zu quantifizieren. (E) Quantifizierung von Prozent MHCI+ von NeuN+ Zellen nur in Medien und IFN-behandelten Neuronen. (F) Quantifizierung der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) von MHCI auf NeuN+ Zellen in Medien (schwarz) und IFN-behandelten (roten) Neuronen. Die statistische Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test berechnet. **, P < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Neuron Growth Media (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 50 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 Ergänzung</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasale Medien</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FACS Puffer (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 500 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetales Rinderserum</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Papain Dissoziationslösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Für 1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain Suspension</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0,001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Überwinterung-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hinweis: Das benötigte Volumen der Papain Dissociation Solution hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden. Bereiten Sie 0,5 ml pro Gehirn für Hippocampus-Neuronen oder 1,0 ml pro Gehirn für kortikale Neuronen vor.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hinweis: Bereiten Sie die Dissoziationslösung vor, indem Sie die Papainsuspension im Hibernate-E ca. 3 min auswirbeln. Nachdem Papain gründlich aufgelöst ist, fügen Sie DNase I hinzu. Wirbel DNase I nicht.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Medien und Lösungen.

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Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung primärer Hippocampus-Neuronen aus dem embryonalen Maushirn. Der Ausdruck der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I auf der extrazellulären Oberfläche kultivierter Neuronen wird dann durch zytometrische Flussanalyse bewertet.

Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.4K Aufrufe.  University of North Carolina at Charlotte. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung primärer Hippocampus-Neuronen aus dem embryonalen Maushirn. Der Ausdruck der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I auf der extrazellulären Oberfläche kultivierter Neuronen wird dann durch zytometrische Flussanalyse bewertet.

Serie: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Neurowissenschaften

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Medizin

Quantifizierung der Histonmodifikation des Mausgehirns mittels Durchflusszytometrie

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

Autor im Rampenlicht: Verbesserungen in der Forschung zur Genexpressionsregulation

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Zusammenfassung

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Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns