Diese Arbeit wurde von der American Heart Association und der Kinder-Kardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001) und den National Institutes of Health (HL114669) unterstützt. CM ist ein Empfänger eines Postdoc-Forschungsstipendium Stipendium der Stiftung Myokarditis, NJ ausgezeichnet.

Ethikerklärung: Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität von Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE genehmigt. 1. Induktion von EAE <ol><li> Um EAE zu induzieren, bereiten das Peptid / komplettem Freund-Adjuvans (CFA) als Emulsion in 11 mit den folgenden Modifikationen: Schritt 1.1:. Vorbereitung PLP 139-151 in einer Konzentration von 1 mg / ml in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Schritt 1.4:. verwenden 200 &amp;mgr; l CFA-Emulsion, enthaltend 100 &amp;mgr; g PLP 139-151 pro Tier Schritt 1.4.1: zehn Tiere zu immunisieren, bereiten 2 ml Emulsion durch Mischen von 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) und ein gleiches Volumen von CFA Schritt 1.5: Injektion von 200 &amp;mgr; l Emulsion in geteilten Dosen subkutan in den beiden Leistenbereichen (~ 75 &amp;mgr; l jeweils) und Brustbeinregion (~ 50 &amp;mgr; l) von fünf bis sechs Wochen alten FEMAle SJL / J-Mäusen. Die Schritte 1.7 und 1.8 gelten nicht für die Induktion von EAE. </li></ol> 2. Klinische Bewertung von EAE Mäusen und Ernte von Cerebrums <ol><li> Überwachen Sie die Tiere für Auftreten von klinischen Zeichen und erzielt das Krankheitsschwere täglich von 9. Tag nach der Immunisierung wie folgt: 0 - gesund; 1 - schlaffer Schwanz oder Hinterbein Schwäche aber nicht beides; 2 - schlaffer Schwanz und Hinterbein Schwäche; 3 - teilweise Lähmung der Hinterbeine; 4 - vollständige Lähmung der Hinterbeine; 5 - moribund oder tot 12. </li><li> Euthanize die Mäuse, wenn sie eine neurologische Score von 3 oder 4 mit CO 2 zu erreichen. Um die Mäuse einschläfern, Pre-füllen die Euthanasie Kammer zunächst mit CO 2 durch Drehen der Regler der CO 2-Tank nicht mehr als 6 psi und damit die Tiere in der Kammer für ca. 5 min zu bleiben, um komplette Asphyxie zu erreichen. Weichen Sie die Tiere eingeschläfert in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einem absorbierenden Kissen und mit einem Paar von sterilSteinpilze und Schere entlarven die Herzen durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen. </li><li> Graben Sie den Schädel durch Kappen der Schädel im Kreis mit einem Paar gebogene Schere, und vorsichtig, drehen Sie die Schädelknochen mit einer Pinzette. Ernten Sie das Gehirn stumpf und mit einem sauberen Skalpell, separate Großhirn vom Kleinhirn. Legen Sie das Großhirn in ein Röhrchen mit kaltem 1x PBS und verlassen die Röhrchen auf Eis, bis die Verarbeitung. </li></ol> 3. In-situ-Färbung der Hirnschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA n) / PLP 139-151 Dextramers <ol><li> Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelzenden Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. </li><li> Legen Sie das Großhirn in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette gehalten über Eis und gießen geschmolzene (40 ° C) Agarose. Unmittelbar, drücken Sie die Großhirn sanftmit einer Zange, um das Gewebe einzutauchen. Lassen Sie die Kassette auf Eis für 15-20 Minuten, bis die Erstarrung abgeschlossen ist. </li><li> Füllen Sie die Badewanne mit Vibratoms gekühlt 1x PBS. Füllen Sie den Raum um Vibratoms Badewanne mit Eiswürfeln, die Temperatur des PBS zwischen 0 und 2 halten ° C. Fix eine saubere Rasierklinge in die Vibratom und den Blattwinkel bis 15 °. </li><li> Platzierung von Gewebe in Vibratom. Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe und die Bauchseite des Großhirns etwas aussetzen. <ol><li> Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche freigelegt, indem die Bauchfläche des Großhirns über den Kleber für Schnitte quer. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt. </li><li> Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen. </li></ol></li><li> In der Zwischenzeit legen Sie das Gewebe chamMitglieder einer pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Vertiefungen der Gewebekammern mit 1 ml kaltem 1x PBS mit, und lassen Sie die Platte auf Eis. <ol><li> Die Gewebekammern vorbereiten durch das Anbringen einer dünnen Nylon Netz zum Schnitt-Ende einer 25 ml-Polypropylen-Pipette mit Superkleber; nach dem Abschneiden der überschüssigen, Gitter um die Pipette, schneiden die Pipette bis zu einer Länge von 1 cm aus dem Netz. </li></ol></li><li> Senken Sie die Vibratom Klinge auf das Niveau von der Oberseite des Gewebes; stellen Sie die Geschwindigkeit Vibratoms 0,22 mm / s einsetzen und schneiden mit einer Vorwärtsbewegung bis 200 um dicke Schnitte zu machen. Bringen Sie ein Gehirnschnitt pro auch mit einem weichen Pinsel Aquarell in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte vollständig Gewebeabbau zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um in insgesamt drei Abschnitte gepaart aus drei verschiedenen Regionen des Gehirns dorsalen zum ventralen Oberfläche (Abbildung 2) zu erhalten. Ein Abschnitt auswobei jedes Paar (insgesamt drei Abschnitte) in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit spezifischen dextramers bezeichnet (IA e / PLP 139-151) und anti-CD4. Ebenso sind ein weiterer Satz von drei Abschnitten, die in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit Steuer dextramers bezeichnet (IA e / TMEV 70-86) und anti-CD4. </li><li> Übertragen Sie die drei Gewebekammern, die die für die Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die, 300 ul einer Cocktail enthält Allophycocyanin (APC)-konjugierte PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-Phycoerythrin (PE, 5 ug / ml) in Blockierungslösung (1 × PBS mit 2% normalem Ziegenserum) wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. </li><li> Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro wir bezeichneten Abschnittell, in denen 300 &amp;mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. Hinweis: Lesen Sie Massilamany et al, 8 für die Zubereitung von dextramers und Dextranmoleküle vorzubereiten dextramers wurden freundlicherweise von Immudex, Kopenhagen, Dänemark, zur Verfügung gestellt.. </li><li> Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt. </li><li> Nach der Inkubationszeit, waschen Gewebeschnitte auf dem Schaukel Plattform, durch die Gewebekammern Übertragung zu einem frischen und mit 1 ml kaltem 1x PBS, und vermeiden Sie Dribbling den Inhalt eines gut in die andere. Waschen dreimal wiederholt, so dass mindestens 10 min pro Waschgang. Sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte nicht getrocknet, wie sie an den Seiten der Kammer Stick. </li><li> Befestigen Sie die Teile durch die Übertragung der Gewebe chamMitglieder in eine frische und in 24-Well-Platte mit 1 ml 4% gefiltert PBS-gepufferte Paraformaldehyd (pH 7,4) auf einem Schaukel Plattform für 2 Stunden mit sanften Drehungen. </li><li> Waschen dreimal wiederholt, wie in Schritt 3.10. </li><li> Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte auf einer sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitt, und montieren Sie den Abschnitt mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen. </li><li> Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C </li></ol> 4. Induktion von EAM und Sammlung der Herzen <ol><li> EAM induzieren, wie in Referenz 11 beschrieben. </li><li> Euthanize die Mäuse am Tag 21 nach der Immunisierung mit Reinraum mit CO 2-Gasflasche ausgestattet, und genießen Sie die Tiere in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einer saugfähigen Unterlage und mit Hilfe einer Pinzette und Schere das Herz aussetzens durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen. Sammeln Sie die Herzen und in Röhrchen mit kaltem 1x PBS. </li></ol> 5. In-situ-Färbung von Herz-Abschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA k) / Myhc 334-352 Dextramers <ol><li> Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelz Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40 &#160; ° C Wasserbad bis zur Verwendung. </li><li> Legen Sie die Herzen in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette auf Eis gehalten, und gießen geschmolzene Agarose bei 40 ° C bis die Gewebe vollständig untergetaucht, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Folgen Sie Schritt 3.3. </li><li> Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe leicht und setzen die Basis des Herzens. Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche, indem die freigelegte Oberfläche desHerz über den Leim. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt. <ol><li> Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen. </li></ol></li><li> Folgen Sie den Schritten 3.5 und 3.6. </li><li> Übertragen Sie die Herzen Abschnitte mit einem Aquarell weichen Bürste in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte ist komplett um den Abbau des Gewebes zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um insgesamt zu erhalten, gepaart acht Abschnitte von der Spitze zur Basis des Herzens (Abbildung 2). Legen Sie alle Teile in Gewebekammern, die Zuweisung von bis zu 3 Abschnitte pro Kammer. Ein Abschnitt von jedem Paar (insgesamt acht Bereiche) zum Färben mit spezifischen dextramers (IA k / Myhc 334-352) und anti-CD4 bezeichnet. Ebenso wird ein anderer Satz von acht Abschnitten Färbung mit Steuer dextramers (IA k / RNase 43-56) und anti-CD4 bezeichnet. </li><li> Übertragen Sie diedrei Gewebekammern mit den zur Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die 300 &amp;mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem Myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) und Anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. <ol><li> Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer je gut bezeichneten Abschnitte, in denen 300 ul einer Cocktail enthält APC-konjugierte RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. </li></ol></li><li> Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt. </li><li> Folgen Sie den Schritten, 3,10-3,11 </li><li> Wiederholen Sie den Wasch thrEis, wie in Schritt 3.10. </li><li> Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte (bis zu drei Abschnitte / Folie) auf einem sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitte, und montieren Sie die Abschnitte mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen. </li><li> Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C. </li></ol> 6. Analyse Dextramer + (dext +) CD4 + T-Zellen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) (die für beide Gehirn und Herz Sektionen) <ol><li> Verwenden Sie Nikon Eclipse-A1-90i konfokalen Mikroskop-System für die routinemäßige Scannen und Erfassen von Bildern. Zum Starten klicken Sie auf Öffnen der NIS-Elements AR-Software (Version 4.13). <ol><li> Wählen Sie &quot;TRITC&quot; und &quot;Cy5&quot;-Kanäle von der Platte. Die Anregungs-/ Emissionswellenlängen jeweils für TRITC-und Cy5-Kanäle, 561,5 nm / 553-618 nm und 640,7 nm / 663-738 nm standardmäßig angezeigt. </li><li> Weisen Sie die Falsch &quot;grün&quot; und &quot;rot&quot; für das TRITC (CD4-PE) und Cy5 (dextramer-APC)-Kanäle auf. </li><li> Legen Sie die Folie, um auf dem Mikroskoptisch untersucht werden und sich manuell unter 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die &quot;HV&quot; auf 110 und Offset auf &quot;0&quot;. Klicken Sie auf &quot;Focus&quot; und stellen Sie die &quot;Spannung&quot; um die Laser zu optimieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Focus&quot;; Scannen Sie den Abschnitt von oben nach unten, und stellen Sie die &quot;Z&quot;-Ebene für die Bildaufnahme. Klicken Sie auf &quot;CH-Serie&quot; und das Bild nacheinander zu erwerben. Identifizieren dext + CD4 + T-Zellen erscheinen als gelbe punktförmige Zellen auf Co-Lokalisation der Signale sowohl von der rot (dextramers) und Grün (CD4)-Kanäle generiert. </li></ol></li><li> Verwenden Olympus-BX60 FV500 Konfokalmikroskop für die einfache quantitative Aufzählung von dext + CD4 + T-Zellen. Um zu beginnenKlicken offen, der FluoView-Software (Version 4.3). <ol><li> Wählen Sie die Farbstoffe &quot;Cy3&quot; und &quot;Cy5&quot; aus dem Drop-Down-Menü, und klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;, um die jeweiligen Laser laden. Hinweis: Die Anregung / Emissionswellenlängen für Cy3 (543 nm / pseudocolored &quot;grün&quot;; CD4-PE) und Cy5 (633 nm / pseudocolored &quot;rot&quot;, dextramer-APC)-Kanäle. </li><li> Legen Sie die Folie, um auf dem Objektträger untersucht werden, und konzentrieren es manuell unter geringer Vergrößerung (4x oder 10x). Klicken Sie auf &quot;Focus&quot;, während die Cy3-Laser ist, und konzentrieren den Entzündungsherd. </li><li> Ändern Sie das Ziel, 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die Dateigröße auf &quot;512/512&quot; aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf &quot;Focus&quot; und passen Sie die Werte für &quot;PMT&quot;, &quot;Gain&quot; und &quot;Offset&quot;-Parameter, um die Laser für Cy3 und Cy5 separat zu optimieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Z-Stufe&quot;, und klicken Sie dann auf &quot;Focus&quot;, während sowohl die Laser auf. Setdie Dicke der &quot;Z-Stufe&quot;, indem Sie auf die &quot;up&quot; und &quot;down&quot; Pfeile. Stellen Sie die &quot;Z&quot;-Intervall auf 2 um. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Stop&quot;, und wählen Sie &quot;Seq123&quot;. Klicken Sie dann auf &quot;XYZ&quot; und starten Sie den Erwerb &quot;Z&quot;-Serie Bilder für den ausgewählten Bereich innerhalb der Entzündungsherd. Speichern Sie die &quot;Z Serienbilder&quot; als AVI-Dateien. Um die Bilddateien zu speichern, wählen Sie das Bild aus der &quot;Z Serienbild&quot;, und speichern Sie dann als &quot;tiff&quot;-Format. </li></ol></li><li> Untersuchen drei gekoppelten Abschnitte aus dem Großhirn, wo ein Satz von drei Abschnitten mit IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 und der andere Satz aus drei Abschnitten mit IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 ausführen gefärbten quantitative Analyse. <ol><li> Auf ähnliche Weise analysieren acht gepaarten Abschnitte für Herz, in dem wurde ein Satz von acht Abschnitten mit IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 und ein anderes an sich gefärbtt aus acht Abschnitten mit RNase 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie 10 bis 15 pro Abschnitt Entzündungsherde in Gehirn-, und in jedem der Schwerpunkte erwerben einen Satz von 15 bis 25 Serienbilder nacheinander. <ol><li> Untersuchen insgesamt 20 Entzündungsherde aus allen acht Abschnitten des Herzens und von jedem Fokus nacheinander erwerben 10 bis 15 Serienbilder. Nehmen Sie die &quot;Z&quot; Serien Bilder durch Scannen der Dias in einem &quot;Horizontal-Vertikal-up-Horizontal-Vertikal-down&quot;-Bewegung, so dass die Wiederholung der &quot;Z&quot;-Serie in der gleichen Fokus wird vermieden. </li><li> Nachdem Serienbilder &quot;Z&quot; werden erfasst, benennen Sie die Dateien durch die Identifizierung der Foliennummern, Namen der Abschnitte, und die Anzahl der &quot;Z&quot; Serienbilder gemacht. <ol><li> Verwenden Sie &quot;ImageJ&quot;-Software, um dext + CD4 +-T-Zellen zu zählen im Verhältnis zu der Gesamtzahl der CD4 + T-Zellen. Wählen Sie die &quot;Art des Gegen &#39;in&#39; ImageJ, überprüfen &amp;# 8216, alle zeigen &quot;und anfangen zu zählen, indem Sie auf die Mitte jeder Zelle und zählt weiter in verschiedenen &#39;Z&#39; serielle Bilder mithilfe Seiten Pfeilen. Nachdem wir all die CD4 T-Zellen zu zählen, wählen Sie eine andere Art von Zähler und zählen die CD4 +-T-Zellen dext. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse, um die Gesamtzahl der Zellen mit den zwei verschiedenen Zählern gezählt zu bekommen. </li><li> Um die Gesamtzahl zu erhalten, fügen Sie die Anzahl der Zellen in allen &#39;Z&#39; seriellen Bilder, die alle drei Gehirnschnitten oder alle acht Abschnitte Herzen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt wurden.

Im Gegensatz zu MHC-Klasse-I-Tetrameren, die Verwendung von MHC-Klasse-II-Tetramere für Routine-Anwendungen weiterhin eine Herausforderung sein, vor allem um die Vorläuferfrequenzen niedriger Affinität autoreaktiven CD4-T-Zellen, was zum Teil auf ihre Aktivierung Abhängigkeit 6,15-17 aufzuzählen. Kürzlich wurde dieses Problem durch die nächste Generation von Tetrameren, genannt umgangen &quot;dextramers&quot; uns erlaubt, Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen für eine Vielzahl von Autoantigenen, wie PLP ...

Die Verwendung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II Tetramere zum Nachweis von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen war eine Herausforderung 1-7. Um die Nachweisempfindlichkeit von MHC-Klasse II Tetramere zu steigern, hat das Forschungsteam der nächsten Generation Tetramere, bezeichnet &quot;dextramers&quot; 8 erstellt. Dextramers enthalten Dextran-Backbones, in denen mehrere Streptavidin-Fluorophoreinheiten konjugiert sind, so dass mehrere Peptid-gebundenen, biotinylierten MHC-Monomere kann auf eine Dextranmolekül 9 befestigt werden. Somit können große Aggregate von MHC dextramers die mehrere MHC-Peptid-Komplexe enthalten, mit mehreren T-Zell-Rezeptoren (TCRs) interagieren. Diese Gruppe zuletzt erzeugten dextramers für verschiedene Autoantigene und gezeigt, dass die Erfassungsempfindlichkeit der dextramers war ungefähr fünfmal mehr als 8 Tetramere. Die experimentellen Systemen gehören experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Proteolipid-Protein (PLP) 139-151 in SJL-Mäusen induziert; EAE mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35-55 in C57BL / 6 Mäusen; und experimentellen autoimmunen Myokarditis (EAM) mit Herz Myosin-α (Myhc) 334-352 in A / J-Mäusen induziert. Diese Studie demonstriert die Verwendung von PLP 139-151 - 334-352 und Myhc dextramers um Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen erkennen, in situ mit Spezifität durch die Entwicklung eines direkten Färbungsprotokoll, wodurch die Notwendigkeit, um die Signale unter Verwendung von Fluorophor-Antikörper verstärken eliminiert, eine Ansatz häufig mit der Verwendung von Tetrameren eingesetzt. Zusätzlich wurde ein umfassendes Verfahren zur Bewertung Gewebe auch entwickelt worden, um zuverlässig Aufzählung der Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ 10. Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen in situ ermöglicht Abgrenzung von Ereignissen durch spezifische antigene Stimuli von den durch Bystander-Aktivierung verursacht. Ebenso ist die in situ-Technik auch provides Möglichkeiten, die Kinetik der Antigen-spezifischen T-Zell-Infiltration in den Zielorganen zu verfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In diesem Bericht, in-situ-Detektion von Antigen-spezifischen, autoreaktive CD4-T-Zellen durch direkte Färbung mit MHC-Klasse-II dextramers beschrieben. Frisch geschnittene Hirnschnitte wurden von EAE-Mäusen gewonnen und mit Cocktails enthalten PLP 139-151 (spezifischen) oder TMEV 70-86 (Kontrolle) dextramers und anti-CD4 gefärbt. Die Top-Platten in Abbildung 1 zeigt LSCM Analyse von Hirnschnitten mit PLP 139-151 dextramers (rot) und CD4-Antikörper (grün), wobei die Doppel-positiven Zellen...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K Aufrufe.  University of Nebraska, Lincoln.  Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt. 

Serie: In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Stabilität und Struktur der Fledermaus Haupt Histokompatibilität Komplex Klasse I mit heterologen β2-Mikroglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...