Diese Arbeit wurde vom österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF, P20619 und P22988 zur BZ) unterstützt.

Mikrowelle Probenvorbereitung <ol><li> Vor Beginn der Probenvorbereitung muss man die automatischen Mikrowelle Gewebeprozessor für Elektronenmikroskopie (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Wien, Österreich) Programm mit der folgenden Protokolle (Tabelle 1) für Mikrowellen unterstützte Probenvorbereitung für die TEM: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Protokoll zur Probenvorbereitung mit Mikrowellenbestrahlung. Die einzelnen Spalten zeigen (von links nach rechts): <ol><li> Ampulle Reihe (Fläschchen nr.) Stellt die Reihenfolge, in der die Flasche in das Karussell von dem Prozessor geladen wird. </li><li> Schritt des aktuellen Prozesses. </li><li> Reagenzien in den Fläschchen. </li><li> Dauer des aktuellen Schritt. </li><li> Maximale Temperatur, die in dem Fläschchen erreicht wird, bevor der Mikrowellenbestrahlung wird ausgeschaltet. </li><li> Mikrowellenbestrahlung Einstellung: Continuous = schnelle Temperaturwechsel Schrittenase, hält die eingestellte Temperatur; sanften Neigung = Temperaturanstieg, Endtemperatur am Ende erreicht; Pulsed = Rapid Temperaturerhöhung, Strom abgeschaltet, bis die Temperatur 5 ° C gesunken, Stromversorgungswiederherstellung um Temperatur zu erreichen. </li><li> Maximale Leistung der Mikrowellenstrahlung. </li></ol></li><li> Frisch bereiten die Lösungen für die verschiedenen Schritte der Probenvorbereitung Protokoll (Agar 100 Epoxidharz siehe 1.7) beschrieben, füllen sie in die dafür vorgesehenen Flaschen gemäß der programmierten Protokoll (Tabelle 1), laden Sie die Fläschchen auf dem Karussell, dann legen Sie die Karussell in der Mikrowelle Gewebeprozessor und schließlich laden die erste Fläschchen in den Mono-Modus Kammer. </li><li> Schneiden Sie kleine Abschnitte der Blätter (1mm 2) von Nicotiana tabacum mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) mit einer Rasierklinge auf einem Modellierwachs Platte in einem Rückgang von 3% Glutaraldehyd (Agar Scientific Ltd, Stansted, England) in 60 mM Sørensen infiziert Phosphatpuffer (pH 7,2) bei Raumtemperaturtur. </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte mit feinen Pinzette sofort in den dafür vorgesehenen Körbe mit einer Maschenweite von ca. 200 um. Stapeln Sie die Körbe auf der jeweils anderen und fügen Sie sie in den Mono-Modus Kammer. Es muss darauf geachtet, dass die Proben ständig mit Fixierlösung während des Ladens und Stapeln der Körbe so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden. </li><li> Starten Sie die zuvor programmierten Mikrowelle Probenvorbereitung Protokoll zur Fixierung, Entwässerung und Infiltration. </li><li> Während der Probenvorbereitung wird automatisch durch die Mikrowellen-Gewebe Prozessor durchgeführt mit negativer Färbung mit dem verbleibenden Pflanzenmaterial, wie in Abschnitt 3 (negative Färbung) beschrieben fort. </li><li> Frisch zubereiten Agar 100 Epoxidharz durch Mischen der folgenden Komponenten beschrieben: fill 24g Agar 100, 16g Dodecenylbernsteinsäureanhydrid und 10 g Methyl-Nadinsäureanhydrid (für alle Komponenten zu sehen Agar Scientific Ltd, Stansted, England) in einem Plastikbecher, Wärme es40 ° C und gut mischen. Fügen Sie 1,2 g Benzyldimethylamin und gründlich mischen. Füllen Agar 100 Epoxidharz in die bezeichnete Polymerisation bildet kurz vor der Probenvorbereitung Protokoll endet (zB während des Schritts 22 in Tabelle 1). </li><li> Nachdem das Protokoll beendet ist (nach Schritt 22 in Tabelle 1) freizugeben die gestapelten Körbe mit den Proben aus dem infiltrierten Mono-Modus-Kammer in den letzten Gefäß des Karussells. Entfernen Sie das Karussell aus dem Mikrowellengerät, entstapeln die Körbe und laden Sie sie mit feinen Pinzette in die vorgesehenen Polymerisation Formen. Es muss darauf geachtet, dass die Proben immer mit Agar 100 Epoxidharz beim Entstapeln und Laden so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden. </li><li> Stapeln Sie die Polymerisation bildet sich auf der jeweils anderen. Es muss darauf geachtet, dass die Proben immer mit Agar 100 Epoxidharz beim Stapeln und Verladen so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden. </li><li> Entfernen Sie zuvor verwendeten Fläschchen aus dem Karussell der Mikrowelle tissue Prozessor, laden Sie es mit den gestapelten Körbe und legen das Karussell in die Mikrowelle Gewebe Prozessor. </li><li> Starten Sie die zuvor programmierten Polymerisation Protokoll (Tabelle 1). </li><li> Während der Polymerisation wird automatisch durch die Mikrowelle Gewebeprozessor durchgeführt, untersuchen negativ gefärbten Netzen mit einem Transmissionselektronenmikroskop [zB Philips CM10 TEM, FEI (vormals Philips), Eindhoven, Niederlande] und führen Bildanalyse, wie in Abschnitt 3 und 4 (beschrieben negative Färbung und Bildanalyse). </li><li> Nachdem das Protokoll abgeschlossen entfernen Sie die Polymerisation bildet sich aus dem Mono-Modus Kammer unstack die Polymerisation Formen und entfernen Sie die polymerisierten Blöcken mit den Proben. Sie sind nun bereit, geschnitten werden mit einem Mikrotom. </li></ol> 2. Trimmen und Schneiden <ol><li> Legen Sie einen oder mehrere Blöcke in separate Probenhalter für ultradünne Schnitte mit der Probe auf Kleben ca. 1cm aus der Halterung. </li><li>Schneiden Sie den Block mit einer Probe Trimmer für TEM (zB Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), so dass ein Block Gesicht max. 1mm in der Länge und in der Breite 200 um was soviel Blattmaterial wie möglich erreicht (Block Gesichtsgröße möglicherweise an der Größe des Diamantmesser eingestellt werden) enthält. </li><li> Abschnitt den Block mit einem Ultramikrotom (z. B. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) mit einem Diamant-Messer an einem Messer Winkel von 45 ° (zB Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Österreich). Schnittdicke sollte etwa 70 bis 90 nm eingestellt werden und die Schnittgeschwindigkeit sollten etwa 1mm / s sein. Pick-up mehrere Abschnitte mit einer Formvar (Agar Scientific Ltd) beschichteten Kupfer oder Nickel 200 Quadratmeter Polygonnetz. </li><li> Post-Flecken auf den Abschnitten auf dem Gitter mit Bleicitrat (Agar Scientific Ltd; 1.1g Bleicitrat in 42ml doppelt destilliertem Wasser und 8 ml 1N NaOH gelöst) für 5 Minuten in einer Petrischale teilweise mit NaOH gefüllt, um einen CO 2-freie erstellen Umwelt und für 15 kmnuten mit 1% Uranylacetat (Agar Scientific Ltd) in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Waschen Sie die Gitter mit destilliertem Wasser für 1 Minute zwischen jeder post-Färbung Schritt. An der Luft trocknen Gittern in einer Gitterbox. </li><li> Untersuchen Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop (zB Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Niederlande). </li></ol> 3. Negative Färbung <ol><li> Ernte etwa 100 mg TMV-infizierten Blattmaterial und vorbereiten Rohsaft durch Homogenisierung des Materials für 2 Minuten mit einer Rasierklinge auf einem Objektträger in 100 &amp;mgr; l 60 mM Søfrensen Phosphatpuffer (pH 7,2). </li><li> 20 ul Übertragen des resultierenden Homogenats auf die erste Vertiefung einer Teflon beschichteten Objektträger mit vier oder mehr Vertiefungen (alternativ ist es auch möglich, das Homogenat auf einem Stück Parafilm übertragen). </li><li> Legen Sie eine Formvar beschichtete Gitter auf der Oberseite des Homogenat mit dem Formvar (Agar Scientific Ltd) beschichtet zugewandten Seite des Tropfens und incubate es für 5 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Gitter 2 mal für jeweils 2 Minuten, indem Sie das Gitter auf der Oberseite zwei Tropfen 200 ul 60 mM Sørensen Phosphatpuffer (pH 7,2). </li><li> Inkubieren des Rasters für 1 Minute mit einer frisch hergestellten 2% Phosphorwolframsäure (Agar Scientific Ltd)-Lösung in 60 mM Sörensen-Phosphatpuffer (pH 6,5). </li><li> Entfernen Sie das Gitter und lassen Sie es trocken in einer Gitterbox Luft. </li><li> Untersuchen Sie das Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (zB Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Niederlande). Nehmen mindestens 10 Bilder zufällig ausgewählt negativ gefärbten Virionen (mindestens 10 oder mehr Virionen sollte auf jedem Bild sichtbar) mit dem Transmissions-Elektronen-Mikroskop bei einer Vergrößerung von primären 21000X oder höher. Es muss darauf geachtet, dass alle Bilder die gleiche Vergrößerung haben. </li></ol> 4. Bildanalyse <ol><li> Messung der Länge und Breite von mindestens 100 zufällig ausgewählten einzelnen Viruspartikel zu den Aufnahmen entnommen ausdie negativ gefärbten Proben mit einem beliebigen Bildanalyse Software [z. B. Cell D (Olympus, Leben und Material Science Europa GmbH, Hamburg, Deutschland) mit dem Partikel-Analyse-Tool oder Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Berechnen Mittelwerten und Standardabweichungen, um eine durchschnittliche Länge und Breite der Viruspartikel visualisiert durch negative Färbemethoden und TEM erreichen. </li><li> Vergleichen Länge und ultrastrukturelle Eigenschaften (erhalten in 2,5) mit einer Größe von Viren und ultrastrukturelle Veränderungen durch Viruserkrankungen in der Literatur, um bekannt eindeutig zu identifizieren das Virus induzierten Krankheiten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach mikrowellenunterstützten Probenvorbereitung typischen TMV-induzierte ultrastrukturelle Veränderungen wie große Flächen enthaltenden Virionen in paralleler Form ausgerichtet könnte mit dem Transmissionselektronenmikroskop im Cytosol von infizierten Nicotian beachtenein tabacum-Zellen (Abb. 1A). Zusätzlich ist in dem Roh-Saft von TMV-infizierten Blätter TMV-Partikel könnten als flexuous, stabförmigen Strukturen nach Negativfärbung (Abb. 1B) beobachtet werden. Bildanalyse von 100 Viruspartikel ergab eine durchschnittliche Größe für TMV von 280nm in der Länge und 17 nm in der Breite (Abb. 2). Die Ultrastruktur in TMV-infizierten Zellen und der Größe von Virionen in dieser Studie beobachtet wurde gefunden, in Übereinstimmung mit TMV-induzierte ultrastrukturelle Eigenschaften in Tabak und dem Größenbereich von TMV-Partikel bereits berichtet in der Literatur 9-15 sein. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen der TMV-infizierten Blatt Zellen und Virionen. A) Das Bild zeigt die Ultrastruktur der TMV-infizierten Mesophyll Blattzellen Nicotiana tabacum nach Mikrowellen-assistierte Anlage Probenvorbereitung. Man beachte die große Fläche von parallel ausgerichteten Virionen, die im Cytosol akkumuliert.C = Chloroplasten mit Stärke (St.), M = Mitochondrium, N = Zellkern, V = Vakuole, Balken = 2 um. B) Das Bild zeigt Virionen, die durch negative Färbung in den Saft des infizierten Blättern nachgewiesen wurden. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Relative Größe der Virionen. Relative Verteilung der Länge und Breite des TMV-Partikel nach negative Färbung der Saft von infizierten Blättern, wenn sie in dem Elektronenmikroskop erschienen. Mittelwerte (mittlere Länge / Breite ± Standardabweichung) wurden aus 100 Virionen berechnet.

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	<li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy. , (1999).</li><li>Kuo, J., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+plant+tissues+for+ultrastructural+study.">Processing plant tissues for ultrastructural study.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. 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Microsc. 233, 258-268 (2009).</li><li>Ler&#237;a, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation,+using+dedicated+hardware,+minimizing+heat-related+effects.">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy.">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications.">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases.">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li><li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy:+a+four-hour+protocol.">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mikrowellenunterstützten Anlage Probenvorbereitung für die TEM ist nachgewiesen worden, eine schnelle und zuverlässige ultrastrukturellen Daten innerhalb von ein paar Stunden 3,4,16 liefern. Die feine strukturelle Erhaltung Organellen und Membranen mit dem in dieser Studie verwendeten erreicht war ähnlich zu konventionellen und cryofixed Proben 5,15 mit dem Vorteil einer massiven Reduktion der Probe Fixierung und Einbetten Zeit von 3 Tagen oder länger auf etwa 2 Stunden. Dies ist die schnellste Probenvorbereitung Protokoll für TEM derzeit in der Literatur. Das Verfahren in dieser Studie beschrieben, kombiniert mikrowellenunterstützten Anlage Probenvorbereitung für die TEM mit negativer Färbung Methoden, die eine eindeutige und schnelle Identifikation von TMV-induzierte ultrastrukturelle Veränderungen und der viralen Agens selbst erlaubt. TMV induzierten ultrastrukturelle Veränderungen könnten nach dem Trimmen, Schneiden und post-Färbung innerhalb von etwa 4 Stunden nach dem Beginn der Fixierung im Getriebe elek untersuchendentron Mikroskop. Verwendung des voll automatisch Probenpräparation Modus befreite den Forscher negative Färbung in der Zwischenzeit führen, um die Größe und Breite des viralen Agens zu bestimmen. So können wir feststellen, dass diese Methode eine klare und schnelle Diagnose von Pflanzenviren Krankheiten in etwa einen halben Tag, die von großer Bedeutung für die zukünftige Verwendung in der Landwirtschaft und wissenschaftliche Experimente im Anlagenbau Phytopathologie ist erlaubt. Da diese Methode könnte auch für die schnelle Diagnose von tierischen und menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden hat es ein großes Potenzial für zukünftige Anwendungen in der medizinischen und veterinärmedizinischen Pathologie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Osmiumtetroxid </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> Agar 100 Harz </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecenylbernsteinsäureanhydrid </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> Methyl Nadinsäureanhydrid </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyldimethylamin </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Bleicitrat </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetat </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> Phosphorwolframsäure </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Neuere Modell ist erhältlich </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultracut S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Neuere Modell ist erhältlich </td></tr><tr><td> Diatome Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (vormals Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Neuere Modell ist erhältlich </td></tr><tr><td> Cell D </td><td> Olympus Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> Media Cybernetics Inc. </td><td></td><td> Neuere Version verfügbar ist </td></tr></tbody></table>

microwave assisted rapid diagnosis of plant virus diseases by transmission electron microscopy

Untersuchungen der ultrastrukturellen Veränderungen, die durch Viren hervorgerufen sind oft notwendig, eindeutig zu identifizieren Viruserkrankungen bei Pflanzen. Bei herkömmlichen Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) solche Untersuchungen kann mehrere Tage dauern 1,2 und sind daher nicht für eine schnelle Diagnose von Pflanzenviren Erkrankungen. Mikrowelle Fixierung kann verwendet werden, um drastisch zu reduzieren Probenvorbereitung Zeit für TEM-Untersuchungen mit ähnlichen ultrastrukturelle Ergebnisse beobachtet, nachdem konventionell Probenvorbereitung 3-5 werden. Viele verschiedene maßgeschneiderte Mikrowellen-Geräte sind derzeit verfügbar, die für die erfolgreiche Fixierung und Einbettung von biologischen Proben für die TEM-Untersuchungen 5-8 verwendet werden. In dieser Studie zeigen wir über Tabak-Mosaik-Virus (TMV) infiziert Nicotiana tabacum Pflanzen, dass es möglich ist, ultrastrukturelle Veränderungen in den Blättern in etwa einem halben Tag zu diagnostizieren, indem mikrowellenunterstützten Probenvorbereitung für TEM. Wir haben uns entschieden, diese Studie mit einem handelsüblichen Mikrowellen Gerät ausführen, wie es Probenvorbereitung führt fast vollautomatisch 5 im Gegensatz zu den anderen verfügbaren Geräte, bei denen viele Schritte noch manuell 6-8 durchgeführt werden und sind daher mehr Zeit und Arbeit in Anspruch. Als Probenvorbereitung vollautomatisch negative Färbung von Viruspartikeln in dem Saft der restlichen TMV-infizierten Blättern und der folgenden Untersuchung der Ultrastruktur und Größe durchgeführt wird, kann während der Fixierung und Einbettung durchgeführt werden.

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Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Diese Studie beschreibt eine Methode, die schnelle und eindeutige Diagnose von Pflanzenviren Krankheiten in etwa einen halben Tag ermöglicht durch eine Kombination von Mikrowellen-assistierte Anlage Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie und negativen Färbemethoden.

Mikrowelle Assisted Schnelle Diagnose von Plant Virus Erkrankungen durch Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Aufrufe.  University of Graz. Diese Studie beschreibt eine Methode, die schnelle und eindeutige Diagnose von Pflanzenviren Krankheiten in etwa einen halben Tag ermöglicht durch eine Kombination von Mikrowellen-assistierte Anlage Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie und negativen Färbemethoden.

Serie: Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...