Wir danken dem Single Cell Open Lab (scOpenLab) am Deutschen Krebszentrum (DKFZ) für hilfreiche Gespräche. Diese Forschung wurde von der Deutschen Krebshilfe, Max-Eder-Programm Fördernummer 70111964 (S.T.) unterstützt.

Frische gefrorene Gliomproben wurden aus der Gewebebank des Nationalen Zentrums für Tumorerkrankungen (NCT) in Heidelberg gewonnen. Die Verwendung von Patientenmaterial wurde vom Institutional Review Board der Medizinischen Fakultät Heidelberg genehmigt und die Einwilligung aller in die Studie einbezogenen Patienten eingeholt.
1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch.</li>
	<li>Vorkühlschläuche, Geschirr, Rasierklingen, Douncer und Stößel auf 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie alle Puffer im Voraus vor. Diese Puffer sind bei Raumtemperatur stabil. Sterilfiltration wird empfohlen, insbesondere für Saccharose. Die Stoffpräparate sind modifiziert von Corces et al.19. Siehe Tabellen 1-7.</li>
	<li>Entfernen Sie Proben aus flüssigem Stickstoff oder -80 °C Gefrierfach und halten Sie sie bis Schritt 2.1 auf Trockeneis.</li>
</ol>2. Gewebedissektion und Dissoziation
<ol><li>Frische gefrorene Gewebeprobe (10-60 mg) in eine vorgekühlte Petrischale geben. Frisches gefrorenes Tuch mit einer Rasierklinge in kleine Stücke auf Eis hacken/ hacken.</li>
	<li>500 μL gekühlter Kernlysepuffer werden in ein vorgekühltes 1,5 ml Röhrchen gegeben. Legen Sie die Gewebestücke in das 1,5-ml-Röhrchen, das den Kernlysepuffer enthält, und geben Sie es in einen Douncer (Materialtabelle). HINWEIS: Es gibt zwei Dounce Homogenisatorstößel: "lose" oder "A" Stößel für die anfängliche Probenreduktion und "tight" oder "B" Stößel für die vollständige Probenhomogenisierung.</li>
	<li>Verdoppeln Sie die Gewebestücke mit dem "losen" Stößel für etwa 20 Hübe, bis die Reibung reduziert ist. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, kann die Probe durch Filtration mit einem 100-mm-Sieb vorgeräumt werden.</li>
	<li>Dounce mit dem "engen" Stößel für 20 Schläge, um eine vollständige Gewebehomogenisierung zu erreichen.</li>
	<li>Das Homogenat (ca. 500 μL) wird in ein vorgekühltes 2 mL Röhrchen überführen. Fügen Sie 1 ml gekühlten Lysepuffer hinzu. Sanft mischen und 5 min auf Eis inkubieren. Vorsichtig mit einer Breitrohrpipettenspitze mischen und während der Inkubation 1-2 mal wiederholen.</li>
	<li>Filtern Sie das gesamte Homogenat mit einem 30 μm Siebgewebe, sammeln Sie es in einem 15 mL Falcon Rohr und geben Sie es wieder in ein neues vorgekühltes 2 mL Rohr um. Ein einzelnes Sieb reicht typischerweise für das gesamte Homogenat aus.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, können Kerne erneut gefiltert werden.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C auf einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ~ 50 μL mit Pellet zurück, das die Kerne enthält. Das Pellet vorsichtig in einem weiteren 1 ml Kernlysepuffer resuspendieren und 5 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4°C. Entfernen Sie den Überstand ohne störendes Pellet, fügen Sie 500 ml 1x Homogenisierungspuffer (HB) hinzu (Tabelle 4) und inkubieren Sie für 5 min ohne Wiederaufwirbeln. Dann resuspendieren Sie die Kerne in einem weiteren 1,0 ml 1x HB.</li>
	<li>Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne vorsichtig in 200 μL 1x HB in ein neues 2,0 ml Röhrchen.</li>
</ol>3. Gradientenzentrifugation
<ol><li>Fügen Sie 200 μL 50% Iodixanollösung (Tabelle 5) hinzu, um eine Endkonzentration von 25% Iodixanol zu erhalten. 10 mal mit Pipette auf 300 ml gut mischen.</li>
	<li>300 μL 29% ige Iodixanollösung (Tabelle 6) werden unter die 25% ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.</li>
	<li>300 μl 35%ige Iodixanollösung (Tabelle 7) werden unter die 29%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden. Achtung: Dieser Schritt erfordert eine schrittweise Entfernung der Pipettenspitze während des Pipettierens, um eine übermäßige Volumenverschiebung zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Proben in eine Schwenkschaufelzentrifuge, drehen Sie sie 20 min bei 3.500 x g bei 4°C mit ausgeschalteter Bremse.</li>
	<li>Entfernen Sie die Proben vorsichtig ohne Zuschütteln und beobachten Sie sie unter Licht. Zwischen der zweiten und dritten Schicht sollte ein klares weißes Band aus 95% reinen Kernen sichtbar sein (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Isolierung von Kernen
<ol><li>Saugen Sie die oberen Schichten an, bis sich die weißen Kerne in der Interphase von 29% -35% banden.</li>
	<li>Sammeln Sie das Kernband in einem Volumen von 200 ml, geben Sie es in ein frisches Rohr und filtern Sie es mit einem 20 μm Filter (Materialtabelle). HINWEIS: Die Kerne müssen vor der Filtration nicht wieder aufgewendet werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden.</li>
	<li>Zählen Sie Kerne mit Trypan-Blaufärbung auf einem Hämozytometer und aliquoten Kernen für snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>5. Einzelkern-RNA und ATAC seq
<ol><li>Sofortige Verarbeitung der Kerne unter Verwendung der Einzelzell-Genexpression und einzelliger ATAC-Reagenz-Kits (Materialtabelle). HINWEIS: Die Kernprobenkonzentrationen für das 10x Genomics-System betragen 1500-3000 Kerne pro μL für snRNA-seq und 3500-7000 Kerne pro m μL für snATAC-seq. Die Kerne können mit 1x PBS verdünnt werden.</li>
	<li>Sequenzieren Sie die resultierenden Bibliotheken in der Genomics Core Facility.</li>
	<li>Führen Sie eine Qualitätskontrollanalyse der Daten durch. Kerne werden für die weitere Analyse einbezogen, wenn sie Unique Molecular Identifier (UMI) >1000, die Anzahl der Gene >500 und Prozent der mitochondrialen Gene <5% enthalten und innerhalb des Mittelwerts + drei Standardabweichungen der UMIs und Gene liegen.</li>
</ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors.">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li><li>Mathys, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+Alzheimer's+disease.">Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Al-Dalahmah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+RNA-seq+identifies+Huntington+disease+astrocyte+states.">Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19 (2020).</li><li>Jakel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+human+oligodendrocyte+heterogeneity+in+multiple+sclerosis.">Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis.</a> Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. , (2018).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+single-cell+analysis+of+transcriptional+and+epigenetic+states+in+the+human+adult+brain.">Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain.</a> Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Bready, D., Placantonakis, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupling+genetics,+lineages,+and+microenvironment+in+IDH-mutant+gliomas+by+single-cell+RNA-seq.">Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq.</a> Science. 355 (6332), (2017).</li><li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma.">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li><li>Weng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Transcriptomics+Uncovers+Glial+Progenitor+Diversity+and+Cell+Fate+Determinants+during+Development+and+Gliomagenesis.">Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).</li><li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrative+Model+of+Cellular+States,+Plasticity,+and+Genetics+for+Glioblastoma.">An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li><li>Al-Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+chromatin+accessibility+reveals+intratumoral+epigenetic+heterogeneity+in+IDH1+mutant+gliomas.">Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201 (2019).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Das Gebiet der intratumoralen Heterogenität befindet sich in einem spannenden Stadium, wobei neuartige Assays und Plattformen entwickelt werden, um das vorhandene Wissen herauszufordern und zu erweitern. Intratumorale Heterogenität ist ein entscheidender Faktor, der zum Fortschreiten der Krankheit und zur Resistenz gegen die derzeitigen Behandlungsmodalitäten bei Gliomen beiträgt28. Jüngste Studien zu Hirntumoren haben sich auf diesen wichtigen Aspektkonzentriert,indem sie einzelli...

Diffuse niedriggrade Gliome (LGG), der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen, sind infiltrative Neoplasmen, die häufig in der Gehirnhemisphäre auftreten. LGGs weisen sowohl inter- als auch intratumorale Heterogenität auf, die nicht nur von der Tumorpopulation, sondern auch von den nicht-malignen Zellen angetriebenwird,die an der Tumorentwicklung und -progression beteiligt sind1,2,3,4,5.
In den letzten zehn Jahren gab es eine Lawine genomischer Daten, die im Bereich der Gliome gesammelt wurden. Diese Daten stammen hauptsächlich aus Massentumorsequenzierungsstudien und haben immens zur molekularen Charakterisierung und der aktuellen Klassifizierung von Hirntumoren5,6,7,8,9,10,11beigetragen . Obwohl diese Studien die breite molekulare Landschaft im Zusammenhang mit Gliomen aufzeigten, gibt es immer noch einen enttäuschenden Mangel an Fortschritten bei der therapeutischen Intervention. Eines der Hindernisse für die Behandlungsresistenz bei Hirntumoren ist die Intratumorheterogenität. Um dieses Problem anzugehen, haben sich verschiedene Studien auf die genomische, transkriptomische, proteomische und epigenetische Heterogenität konzentriert, die in einem Tumor auf Einzelzellebene vorhanden ist12,13,14,15,16,17.
Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte technologische Fortschritte im Einzelzellbereich gegeben hat, ist einer der wichtigsten einschränkenden Faktoren die Verfügbarkeit frischer Proben, die benötigt werden, um die Zellen zu isolieren und diese Experimente durchzuführen. Um diese Einschränkung zu überwinden, gab es mehrere erfolgreiche Versuche, Assays wie snRNA-seq und snATAC-seq aus gefrorenem Gewebe durchzuführen, wobei Kerne anstelle von Zellen verwendet wurden18,19. Die meisten dieser Methoden basieren entweder auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Filtrationsstrategien. Sowohl Einzelzell- als auch Einzelkernansätze haben ihre Stärken und Nachteile. Einzelzellansätze pflegen mitochondriale Transkripte, die zwar informativ sein können, aber aufgrund ihrer hohen Häufigkeit auch die Transkriptomabdeckung reduzieren können. Einzelkernisolationsansätze eliminieren einen hohen Prozentsatz der mitochondrialen Fraktion, wodurch eine tiefergehende Abdeckung der Kerntranskripte ermöglichtwird 20.
Es gibt verschiedene kommerziell verfügbare Plattformen, die in den letzten Jahren verwendet wurden, um Einzelzellgenomikdaten zu untersuchen, einschließlich RNA-seq und ATAC-seq. Eine der bekanntesten Plattformen ist die 10x Genomics Chromium-Plattform für einzellige Genexpression und Einzelzell-ATAC-Profiling. Da die Plattform mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern arbeitet, können Ablagerungen oder Aggregate das System verstopfen, was zum Verlust von Daten, Reagenzien und wertvollen klinischen Proben führt. Daher hängt der Erfolg von Einzelzellstudien weitgehend von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.
Das Protokoll, das wir hier demonstrieren werden, ist eine leicht modifizierte Kombination der Protokolle DroNc-seq und Omni-ATAC-seq und verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, die snRNA-seq verwenden, um neurologische Störungen und neuronale Zelltypen im menschlichen Gehirn zu verstehen18,19,21,22,23,24. Das Protokoll verwendet eine Kombination aus enzymatischer /mechanischer Dissoziation gefrorener Proben, gefolgt von Filtration und Gradientenzentrifugation und ermöglicht eine schnelle und genaue Isolierung einzelner Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus dem gleichen Kernpräparat aus Hirntumorproben zu generieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>Active motif</td>
			<td>40401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol (aka Optiprep)</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>07820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(Ac)2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NUC101-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (20 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe lock tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell ATAC</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Cell Gene Expression</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Bore pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>2079GPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Bore pipette tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>2069GPK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus rna-seq and atac-seq

Adulte diffuse Gliome weisen Inter- und Intratumorheterogenität auf. Bis vor kurzem konzentrierte sich die Mehrheit der groß angelegten molekularen Profiling-Bemühungen auf Massenansätze, die zur molekularen Klassifizierung von Hirntumoren führten. In den letzten fünf Jahren haben Einzelzellsequenzierungsansätze mehrere wichtige Merkmale von Gliomen hervorgehoben. Die meisten dieser Studien haben frische Hirntumorproben verwendet, um einzelne Zellen mit Durchflusszytometrie oder Antikörper-basierten Trennmethoden zu isolieren. In Zukunft wird die Verwendung von frisch gefrorenen Gewebeproben aus Biobanken eine größere Flexibilität für Einzelzellanwendungen bieten. Darüber hinaus wird die nächste Herausforderung mit dem Fortschreiten des Einzelzellfeldes darin bestehen, Multi-Omics-Daten entweder aus einer einzelnen Zelle oder derselben Probenvorbereitung zu generieren, um die Tumorkomplexität besser zu entschlüsseln. Daher werden einfache und flexible Protokolle, die die Datengenerierung für verschiedene Methoden wie Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und Single-Nucleus-Assay für Transposase-Accessible Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (snATAC-seq) ermöglichen, für das Feld wichtig sein.
Jüngste Fortschritte im Einzelzellbereich in Verbindung mit zugänglichen mikrofluidischen Instrumenten wie der 10-fachen Genomik-Plattform haben Einzelzellanwendungen in Forschungslabors erleichtert. Um die Heterogenität von Hirntumoren zu untersuchen, haben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung einzelner Kerne aus frischen gefrorenen Gliomen entwickelt. Dieses Protokoll führt bestehende Einzelzellprotokolle zusammen und kombiniert einen Homogenisierungsschritt, gefolgt von Filtration und puffervermittelter Gradientenzentrifugation. Die resultierenden Proben sind reine Einzelkernsuspensionen, die verwendet werden können, um Einzelkern-Genexpression und Chromatin-Zugänglichkeitsdaten aus derselben Kernpräparation zu generieren.

Die Einzelkerngenomik ist ein sich entwickelndes Feld mit begrenzten Daten und Protokollen. Ein kritischer Faktor, der das Ergebnis von Einzelkernassays beeinflusst, ist die Isolierung reiner und intakter Kerne. Wir haben zwei veröffentlichte Protokolle (DroNc-seq- und Omni-ATAC-seq-Protokolle) kombiniert, um in relativ kurzer Zeit hochwertige und reine Kerne aus frischen gefrorenen Gliomgewebeblöcken zu isolieren und so die Stabilität der Transkripte zu erhalten (Abbildung 1).
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Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.9K Aufrufe.  University Hospital Heidelberg. Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Serie: Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Forschung

Krebsforschung

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Aus Bauchspeicheldrüsenkrebs gewonnene Tumororganoide und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. Patient-derived tumor organoids have been used in translational cancer research and can be applied to assess treatment sensitivity and resistance, cell-cell interactions, and tumor cell interactions with the tumor microenvironment. Tumor organoids are complex culture systems that require advanced cell culture techniques and culture media with specific growth factor cocktails and a biological basement membrane that mimics the extracellular environment. The ability to establish primary tumor cultures highly depends on the tissue of origin, the cellularity, and the clinical features of the tumor, such as the tumor grade. Furthermore, tissue sample collection, material quality and quantity, as well as correct biobanking and storage are crucial elements of this procedure. The technical capabilities of the laboratory are also crucial factors to consider. Here, we report a validated SOP/protocol that is technically and economically feasible for the culture of ex vivo tumor organoids from fresh tissue samples of pancreatic adenocarcinoma origin, either from fresh primary resected patient donor tissue or patient-derived xenografts (PDX). The technique described herein can be performed in laboratories with basic tissue culture and mouse facilities and is tailored for wide application in the translational oncology field.

Autor im Rampenlicht: Etablierung von Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe aus Bauchspeicheldrüsenkrebs  

Tumor organoids have revolutionized cancer research and the approach to personalized medicine. They represent a clinically relevant tumor model that allows researchers to stay one step ahead of the tumor in the clinic. This protocol establishes tumor organoids from fresh pancreatic tumor tissue samples and patient-derived xenografts of pancreatic adenocarcinoma origin.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...