Die einzellige RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Transkriptionsprofilen von Zellen, insbesondere im heterogenen Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von Kernen für die SEQUENZierung von RNA mit einem Kern. Durch die Verwendung von Kernen anstelle von Zellen kann diese Methode auf schwer zu dissoziierendes Gewebe sowie auf gefrorenes Gewebe angewendet werden.
Darüber hinaus kann diese Methode angewendet werden, um zelltypspezifische Veränderungen in Zellen nach Krankheit oder Verletzung zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit mauseulärlicheM, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes machen Sie einen Schnitt entlang der Länge des Körpers, um die inneren Organe freizulegen.
Entfernen Sie die Maus, indem Sie die inneren Organe aus der Körperhöhle mit Zangen ziehen. Verwenden Sie keine Papiertücher, um den Bereich zu reinigen oder Organe zu entfernen, da dies Verunreinigungen mit sich bringen kann. Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule zwischen den Wirbelsäulen L2 und L3.
Um das Rückenmark auszuwerfen, passen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit eiskaltem PBS mit einer 25 Gauge 1/4 Zoll Nadel an. Legen Sie die Spitze der Nadel in das sakrale Ende der Wirbelsäule. Verwenden Sie zwei Finger, um die Wirbel zu kneifen, um eine enge Dichtung um die Spitze der Nadel zu schaffen, und drücken Sie auf den Kolben, um das Rückenmark rostral auszuwerfen.
Das Rückenmark in eine Petrischale mit eiskaltem PBS geben. Wenn nur der Lendenteil des Bandes erforderlich ist, trimmen Sie die sakralen und brustbrustigen Teile des Rückenmarks weg. An dieser Stelle, einfrieren Sie das Gewebe und speichern bei minus 80 Grad Celsius, oder sofort für Waschmittel mechanische Zelllyse, wie hier beschrieben, oder hypotonische mechanische Lyse, wie im Textprotokoll beschrieben.
Um die mechanische Zelllyse des Waschmittels zu bestimmen, legen Sie das Lendenrückenmark in einen vorgekühlten Dounce-Homogenisator und fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühlten Waschmittellysepuffer hinzu. Mit fünf Schlägen des lockeren Stößes A und dann fünf bis zehn Striche des engen Stößes, B.Vermeiden Sie das Heben des Homogenisators außerhalb der Lyselösung zwischen den Strichen, und vermeiden Sie das Einführen von Blasen. Legen Sie nun ein 40-Mikron-Sieb über ein vorgekühltes 50-Milliliter-Konusrohr und vornass mit einem Milliliter niedrigem Saccharosepuffer.
Fügen Sie dem Dounce-Homogenisator, der die Rohkerne im Lysepuffer enthält, einen Milliliter niedrigen Saccharosepuffer strotzen und sanft mischen, indem Sie zwei- bis dreimal pipetieren. Übergeben Sie die rohen Kerne Über das 40-Mikron-Sieb in das vorgekühlte 50-Milliliter-Konische Rohr. Geben Sie einen zusätzlichen einen Milliliter niedrigen Saccharosepuffer über das 40 Mikron Sieb, so dass das Endvolumen auf drei Milliliter des niedrigen Saccharosepuffers und 500 Mikroliter des Lysepuffers.
Wiederholen Sie diese Schritte, wenn Sie mehrere Kabel kombinieren und im selben konischen Rohr abkühlen. Zentrifugieren Sie die Probe dann bei 3200 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Überstand.
Wir unterbrechen die Palette mit drei Millilitern niedrigem Saccharosepuffer. Wirbeln Sie vorsichtig, um das Pellet von der Wand zu entfernen, um die Resuspension zu erleichtern. Nachdem Sie die Probe zwei Minuten auf dem Eis sitzen lassen, übertragen Sie die Suspension auf eine Oak Ridge-Röhre.
Mit dem Homogenisator beim Einsen, homogenisieren Sie die Kerne in niedrigen Saccharosepuffer für 15 bis 30 Sekunden, halten Sie die Probe auf Eis. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um 12,5 Milliliter Dichte-Saccharose-Puffer unter dem niedrigen Saccharosepuffer homogenisieren zu schichten, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blase entsteht, die die Dichteschichten stört. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 mal G, für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.
Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, dekanieren Sie den Überstand sofort in einer flickenden Bewegung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Oak Ridge Rohr sofort aus der Zentrifuge zu entfernen und den Überstand schnell zu dekantieren. Mit 100 Mikrolitern bis zu einem Milliliter Resuspensionslösung setzen wir die an der Wand verbliebenen Kerne aus.
Vermeiden Sie das Myelin Stirnrunzeln, die mit dem Waschmittel-basierte Vorbereitung bleibt. Wenn diese Schritte nicht schnell ausgeführt werden, kann dies zu einer Kernvorbereitung mit überschüssigem Zellabfall oder Myelin führen, das die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung mit einem Kern behindern kann. Filtern Sie die Kerne durch ein 30 bis 35 Mikron Poren-Ssieb und sammeln Sie in einem vorgekühlten Rohr.
Bestimmen Sie die Kernausbeute, indem Sie ein Hämozytometer verwenden, um Kerne unter einem 10-x-Objektiv zu zählen, bevor Sie zur Sequenzierung der RNA mit einem Kern verfahren, wie im Textprotokoll beschrieben. Helle Feld- und Epifluoreszenzbilder von Kernen, isoliert mit dem mechanischen Lyseprotokoll des Waschmittels, werden bei 10 x dargestellt. Diese Kerne werden unvoreingenommen isoliert, was die Untersuchung endogener Genexpressionsprofile auf der Ebene einer einzelnen Zelle ermöglicht.
Hier ist ein repräsentatives tSNE-Diagramm der Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung aus einem Mauslenrückenmitmarksunterrücken mit einer massiv parallelen Tröpfchenverkapselungsplattform. Aus frischem oder gefrorenem Gewebe isolierte Kerne können sowohl auf kommerziellen als auch auf akademischen Plattformen für die Sequenzierung verwendet werden. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Transkriptionsprofile auf einzelzelliger Ebene zu untersuchen, indem schwer zu dissoziierte Gewebe wie das Rückenmark oder sogar gefrorenes Gewebe, wie Biobankmaterial, verwendet werden.
Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, die Zeit zwischen Euthanasie und Zelllyse zu reduzieren. Darüber hinaus ist es wichtig, Blasen zu minimieren, die in Lösungen von der zellulären Lyse bis zur Resuspension eingeführt werden, und Haustierkerne mit Vorsicht zu kaufen. Nach diesem Verfahren können Kerne für alternative Anwendungen, wie z. B. die Facs-Sortierung, verwendet werden, um bestimmte Zelltypen zu isolieren.
