Wir danken Alvi Wadud und Trudi Frost, die bei der Entwicklung und Erprobung von Primer geholfen haben. Die Finanzierung des in dieser Studie berichteten Assay-Designs wurde vom Department of Defense Strategic Environmental Research and Development Program (RC19-1156) bereitgestellt. Jegliche Verwendung von Handels-, Produkt- oder Firmennamen dient nur zu beschreibenden Zwecken und impliziert keine Billigung durch die US-Regierung. Die während dieser Studie generierten Daten sind als USGS-Datenfreigabe https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 verfügbar.

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. Die Fördersponsoren spielten bei der Gestaltung der Studie keine Rolle; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; in der Schrift des Manuskripts; oder in der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Wie bei jeder Studie ist die Definition der zu behandelnden Frage der erste Schritt, und die Gestaltung des eDNA-Tests hängt vom Umfang der Studie ab.26. Wenn beispielsweise das Ziel der Forschung oder Untersuchung darin besteht, eine oder mehrere Arten zu entdecken, ist ein gezielter, auf Sonden basierender Assay am besten. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, eine größere Suite oder Zusammenstellung von Arten zu bewerten, sind Metabarcoding-Assays mit hohem Durchsatz besser geeignet. Sobald festgestellt ist, welchen Ansatz sie wählen soll, wird eine Pilotstudie mit Assay-Design, -Tests und -Optimierung empfohlen.24. Das Assay-Design beginnt mit einer Liste von Arten, wie in Abbildung 1. Diese Liste wird die Grundlage sein, um zu verstehen, wie gut ein Assay in Bezug auf die Spezifität und die geografische Reichweite, die er angewendet werden könnte,6,10. Es wird empfohlen, den Test für ein bestimmtes geografisches Gebiet zu entwerfen, damit der Konstrukteur einen Test auf Kreuzreaktivität gegen andere Arten in diesem Gebiet besser testen kann, und sich der Einschränkungen bewusst zu sein, die dies bei der Ausweitung eines Assays auf andere Gebiete mit sich führen kann, in denen eine Zielart auftreten kann.24. Sobald die Liste vollständig ist, können Sequenzen aus öffentlichen genetischen Datenbanken heruntergeladen werden. Da diese Datenbanken unvollständig sind,27sollte man so viele Arten wie möglich auf der Liste im Haus sequenzieren, um die lokale Referenzdatenbank der Sequenzen zu vervollständigen, die im Assay-Design verwendet werden. Priorisieren Sie ko-häufig auftretende Arten, da dies die wahrscheinlichsten Nicht-Ziele sind, die sich verstärken werden. Die Konzentration auf alle Arten innerhalb derselben Gattung oder Familie wie die Zielart ist ein guter Ausgangspunkt. Vergleiche mit eng verwandten Arten werden dazu beitragen, Sequenzregionen zu identifizieren, die für die Zielart einzigartig sind. Dies kann dazu beitragen, zu informieren, wie der Test in anderen Systemen oder Standorten funktionieren kann. Mitochondriale Regionen sind die übliche Wahl für die Assay-Entwicklung, weil mehr Sequenzinformationen aus einer größeren Vielfalt von Arten an mitochondrialen Genen verfügbar sind, die in Barcodes von Lebensprojekten verwendet wurden, und weil mitochondriale DNA in viel größerer Konzentration in Kopien/Zellen vorhanden ist als Kern-DNA24,28,29. Mehrere Genregionen sollten für die weitere Assay-Entwicklung bewertet werden, da die Sequenzabdeckung zwischen Taxa und den Datenbanken des genetischen Endlagers variiert. Nachdem diese lokale Datenbank mit Referenzsequenzen erstellt wurde, wird eine Kombination aus manueller Visualisierung ausgerichteter Sequenzdaten und Computersoftwareprogrammen verwendet, um die Primer/Probe-Assays zu entwerfen. Man sollte sich nicht streng auf Software verlassen, um zu bestimmen, welche Assays getestet werden sollen. Es ist wichtig, visuell auf Ausrichtungen zu überprüfen, bei denen die Primer und Sonden auf den Zielen und Nicht-Zielen sitzen, um ein besseres Verständnis dafür zu erhalten, wie sie in einer PCR handeln könnten. Schließlich umfasst assay Screening und Optimierung drei Ebenen (in Silico, In-vitro und in situ)6,7,24,25. In silico Design und Tests sind wichtig für die Erstellung einer kurzen Liste von Assays mit einer guten Chance auf Erfolg, aber empirische (in vitro) Tests ist entscheidend für die Auswahl des Tests mit der besten tatsächlichen Leistung. Die In-vitro-Optimierung und das Testen von Assays umfassen die Messung der Reaktionseffizienz und die Definition der Empfindlichkeit und Spezifität des Assays. Die Grenzen der Detektion und Quantifizierung sind zwei Parameter, die bei der Testentwicklung oft übersehen werden, aber für die Dateninterpretation wichtig sind. Durch Ausführen mehrerer Replikationen der Standardkurven für einen Assay können LOD und LOQ1,5,30. Nur wenige Studien diskutieren Ergebnisse in Bezug auf die LOD oder LOQ des Assays, aber Sengupta et al. (2019) integrieren LOD und LOQ ihres Assays in ihre Dateninterpretation und Grafik, um ihre Ergebnisse besser zu verstehen.31. Interne Positivkontrollen sollten auch in den entworfenen Assay einfließen. Ohne Tests auf PCR-Hemmung in den Proben können falsche Negative auftreten24,32. Wir schlagen die Verwendung eines multiplexierten IPC-Assays mit dem Zieltest als einfachste Methode für PCR-Hemmungstests vor.23. Schließlich ist eine In-situ-Prüfung des Assays aus Feld- und Laborproben erforderlich, um sicherzustellen, dass die Zielverstärkung in Umweltproben erfolgt.24.
Für die Verwendung artipeziesspezifischer, sonsweiter qPCR-Assays mit eDNA-Proben bestehen Einschränkungen. Beispielsweise kann das Design mehrerer Testtests durch die Verfügbarkeit von Sequenzen eingeschränkt werden, und es kann zu Kompromissen bei Aspekten der Assayleistung kommen. Diese Entscheidungen müssen sich an den Zielen der Studie orientieren und mit den Ergebnissen26gemeldet werden. Wenn das Ziel beispielsweise der Nachweis einer seltenen Art ist und nur wenige Positive erwartet werden, könnte ein Assay mit unvollkommener Spezifität (d. h. Verstärkung von Nichtzielarten) verwendet werden, wenn alle Detektionen durch Sequenzierung überprüft werden. Wenn das Ziel die Überwachung des geografischen Bereichs einer Art ist und eDNA-Konzentrationsdaten nicht benötigt werden, könnte ein Assay mit unvollkommener Effizienz verwendet und Daten nur als prozentuale Erkennung gemeldet werden. Darüber hinaus kann man, wenn nicht alle potentiellen Konspezifen im Labor getestet werden, was selten möglich ist, nicht mit absoluter Sicherheit die wahre Spezifität eines Assays kennen. Zum Beispiel wurde der Assay an mehreren Süßwassermuschelarten im Clinch River entwickelt und getestet. Um diesen Test in einem anderen Flusssystem zu verwenden, müssten wir ihn an einer Reihe von Arten am neuen Standort testen. Genetische Variation innerhalb der Art oder Population, die während der Assay-Entwicklung nicht getestet wird, könnte sich auch auf die Spezifität auswirken. Schließlich, selbst wenn ein Test auf eine hohe technische Leistung überprüft wurde; Bedingungen ändern sich, wenn Sie vor Ort arbeiten. Nicht-assay-bezogene Bedingungen wie Wasserdurchfluss, pH-Wert und Tierverhalten können die eDNA-Nachweisbarkeit ebenso verändern wie die Verwendung verschiedener eDNA-Sammlungs- und Extraktionsprotokolle. Die Verwendung von Assays, die optimiert und gut beschrieben sind, wird dazu beitragen, das Verständnis des Einflusses solcher Parameter auf die eDNA-Erkennung zu erleichtern.
Der Bereich der eDNA reift über das Stadium der explorativen Analyse hinaus zu einer zunehmenden Standardisierung von Methoden und Techniken. Diese Entwicklungen werden unser Verständnis von eDNA-Techniken, -Fähigkeiten und -Einschränkungen verbessern. Der Optimierungsprozess, den wir oben skizzieren, verbessert die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit eines Assays. Das endliche Ziel dieser Verfeinerung und Standardisierung von eDNA-Methoden ist es, die Fähigkeiten der Forscher zu verbessern, Rückschlüsse auf der Grundlage von eDNA-Daten zu ziehen und das Vertrauen der Endnutzer und Der Stakeholder in die Ergebnisse zu erhöhen.

Forscher und Manager interessieren sich zunehmend für die Verwendung von Umwelt-DNA-Assays für den Artennachweis. Seit drei Jahrzehnten wird quantitative oder Echtzeit-PCR (qPCR/rtPCR) in zahlreichen Bereichen zur sequenzspezifischen Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren1,2eingesetzt. Innerhalb des relativ neuen Feldes der eDNA-Forschung ist die Verwendung dieser Assays mit einer Standardkurve zur Quantifizierung von Kopien der Ziel-DNA pro Volumen oder Gewicht der eDNA-Probe mittlerweile zur Routine geworden. Mitochondriale DNA-Sequenzen werden in der Regel in eDNA-Assays gezielt, da das mitochondriale Genom in Tausenden von Kopien pro Zelle vorhanden ist, aber auch Assays für kernnukleare DNA oder RNA-Sequenzen möglich sind. Es ist wichtig zu verstehen, dass veröffentlichte Assays für eDNA-Proben nicht immer leistungsgleich sind. Die Zuverlässigkeit eines Tests beim Nachweis nur der DNA einer Zielart (d. h. Spezifität) und dem Nachweis geringer Mengen an Ziel-DNA (d. h. Empfindlichkeit) kann aufgrund von Unterschieden in der Art und Weise, wie der Assay entworfen, ausgewählt, optimiert und getestet wurde, erheblich variieren. Die Berichterstattung über quantitative Kennzahlen der Assay-Performance wurde bisher weitgehend übersehen, aber in jüngster Zeit entstehen Standards zur Verbesserung der Transparenz in der Assay-Entwicklung3,4,5,6,7,8.
Optimierung und Berichterstattung von Assay-Leistungshilfen bei der Studiengestaltung und Interpretation von eDNA-Umfrageergebnissen. Assays, die mit der DNA von Nicht-Zielarten kreuzreagieren, können zu falsch positiven Detektionen führen, während Assays mit schlechter Empfindlichkeit die DNA der Zielart nicht erkennen können, selbst wenn sie in der Probe vorhanden ist (falsche Negative). Ein Verständnis der Assay-Empfindlichkeit und Selektivität wird dazu beitragen, die Probenahmebemühungen zu informieren, die erforderlich sind, um seltene Arten zu erkennen. Da es viele natürliche Variationsquellen in eDNA gibt, müssen Studien kontrollierbare Variationsquellen so weit wie möglich begrenzen, einschließlich der vollständig enoptierenden und charakterisierenden eDNA-Assay3.
Bedingungen, die sich direkt auf die Spezifität oder Empfindlichkeit eines Assays auswirken, ändern die Leistung des Assays. Dies kann unter verschiedenen Laborbedingungen (z. B. verschiedenen Reagenzien, Anwendern, Maschinen usw.) auftreten. Daher sollte dieses Protokoll bei der Anwendung eines Assays unter neuen Bedingungen erneut überprüft werden. Auch in der Literatur gut charakterisierte Assays sollten getestet und optimiert werden, wenn sie von einem neuen Labor oder bei Verwendung verschiedener Reagenzien (z.B. Master-Mix-Lösung)5,9übernommen werden. Die Spezifität des Assays kann sich ändern, wenn er auf eine andere geografische Region angewendet wird, da der Test auf Proben aus einer neuen biotischen Gemeinschaft angewendet wird, die Nichtzielarten umfassen können, gegen die der Test nicht getestet wurde, und genetische Variationen in der Zielart auftreten können. Auch hier sollte der Test neu bewertet werden, wenn er an einem neuen Standort verwendet wird. Die Feldbedingungen unterscheiden sich von den Laborbedingungen, da pcR-Inhibitoren im Feld eher in Proben vorkommen. PCR-Inhibitoren wirken sich direkt auf die Amplifikationsreaktion aus und beeinflussen somit die Assay-Leistung. Aus diesem Grund ist bei der Entwicklung eines eDNA-Assays eine interne Positivkontrolle erforderlich.
Schließlich können Die Umweltbedingungen vor Ort die DNA-Moleküle der Zielart und ihre Erfassung durch DNA-Abbau, -Transport und -Retention beeinflussen. Darüber hinaus unterscheiden sich verschiedene Protokolle für die DNA-Sammlung und -Extraktion in ihrer Effizienz und Fähigkeit, DNA zu behalten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Prozesse die Nachweisbarkeit von eDNA beeinflussen, aber nicht die Leistung eines molekularen Assays. Somit ist die Nachweisbarkeit der DNA aus der Zielart in Feldproben eine Funktion sowohl der technischen Leistung des qPCR-Assays als auch der Feldbedingungen und der Sammlungs-, Lager- und Extraktionsprotokolle. Bei der Verwendung eines gut charakterisierten und leistungsstarken Assays können Benutzer sich in die Fähigkeiten des Assays verlassen können. Die Forscher können sich nun auf das Verständnis der externen Assay-Faktoren (d. h. Umweltvariablen, Unterschiede in der Erfassung oder Extraktionsprotokolle) konzentrieren, die die eDNA-Erkennung beeinflussen.
Hier konzentrieren wir uns speziell auf die technische Leistung des Assays durch strenges Design und Optimierung. Wir demonstrieren das Protokoll mit einem sondenbasierten Assay, der für den Nachweis einer Süßwassermuschel, der Mucket (Actinonaias ligamentina), aus Wasser, das im Clinch River, USA, entnommen wurde, entwickelt wurde. Kürzlich haben Thalinger et al. (2020) Richtlinien zur Validierung gezielter eDNA-Assays vorgestellt. Das Assay-Design nach unserem Protokoll wird Thalinger et al. einen Test auf Stufe 4 sowie einen zusätzlichen Schritt in Richtung Stufe 56bringen. An dieser Stelle wird die technische Leistung eines Assays optimiert und für den regelmäßigen Einsatz in Labor- und Feldanwendungen bereitstehen. Der weitere Einsatz des Assays in Labor-, Mesokosmos- und Feldexperimenten kann dann Fragen zur eDNA-Detektion und zu Faktoren, die die Nachweisbarkeit beeinflussen, beantworten, die letzten Schritte für die Validierung der Stufe 56.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Place Reversible Racks with Covers</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>456355AST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>43431, 55090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2681332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC forward and reverse primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge machine</td>
			<td>Various</td>
			<td>-</td>
			<td>Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;B&#39; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 1000 &#181;L F 768A/8</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 20 &#181;L F 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips GP LTS 200 &#181;L F 960A/10</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Various</td>
			<td>Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4396838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target forward and reverse primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target PrimeTime qPCR Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target synthetic gBlock gene fragment</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>custom product. used for qPCR standard dilution series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50728002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications

Neue, nichtinvasive Methoden zur Erkennung und Überwachung des Vorhandenseins von Arten werden entwickelt, um die Fischerei und das Schutzmanagement von Wildtieren zu unterstützen. Die Verwendung von Umwelt-DNA -Proben (eDNA) zum Nachweis von Makrobiota ist eine solche Gruppe von Methoden, die schnell populär wird und in nationalen Management-Programmen implementiert wird. Hier konzentrieren wir uns auf die Entwicklung artspezifischer zielgerichteter Assays für sonsonsbasierte quantitative PCR-Anwendungen (qPCR). Die Verwendung von sondenbasierter qPCR bietet eine größere Spezifität, als dies allein bei Primern möglich ist. Darüber hinaus kann die Fähigkeit, die Menge der DNA in einer Probe zu quantifizieren, für unser Verständnis der Ökologie von eDNA und die Interpretation von eDNA-Detektionsmustern auf dem Gebiet nützlich sein. Bei der Entwicklung und Erprobung dieser Assays ist sorgfältige Berücksichtigung erforderlich, um die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises der Zielarten aus einer Umweltprobe zu gewährleisten. In diesem Protokoll werden wir die Schritte abstecken, die erforderlich sind, um sondenbasierte Assays für den Nachweis einer Zielart zu entwerfen und zu testen; einschließlich Erstellung von Sequenzdatenbanken, Assay-Design, Assay-Auswahl und -Optimierung, Test-Assay-Performance und Feldvalidierung. Wenn Sie diese Schritte ausführen, erhalten Sie einen effizienten, sensiblen und spezifischen Test, der mit Vertrauen verwendet werden kann. Wir demonstrieren diesen Prozess mit unserem Test für Populationen der Mucket (Actinonaias ligamentina), einer Süßwassermuschelart, die im Clinch River, USA, vorliegt.

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Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

Umwelt-DNA-Assays erfordern eine strenge Konzeption, Prüfung, Optimierung und Validierung, bevor mit der Erfassung von Felddaten begonnen werden kann. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Benutzer durch jeden Schritt der Entwicklung eines artspezifischen, sonsonenbasierten qPCR-Tests zum Nachweis und zur Quantifizierung einer Zielart-DNA aus Umweltproben zu führen.

Entwicklung und Prüfung artspezifischer quantitativer PCR-Assays für Umwelt-DNA-Anwendungen

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

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Research

JoVE Journal

Environment

12.6K Aufrufe.  U.S. Geological Survey. Umwelt-DNA-Assays erfordern eine strenge Konzeption, Prüfung, Optimierung und Validierung, bevor mit der Erfassung von Felddaten begonnen werden kann. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Benutzer durch jeden Schritt der Entwicklung eines artspezifischen, sonsonenbasierten qPCR-Tests zum Nachweis und zur Quantifizierung einer Zielart-DNA aus Umweltproben zu führen.

Serie: Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protokolle für Robust Herbizidresistenz Testing in verschiedene Unkrautarten

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Forschung

Umwelt

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory by using pumps and automating delivery of sediment and water to simulate suspension of sediment. FLEES data are used to develop exposure-response curves between the effects on aquatic organisms and suspended sediment concentrations at the desired exposure duration. The effects data are used to evaluate management practices used to reduce the interactions between aquatic organisms and anthropogenic causes of suspended sediments. The FLEES is capable of generating total suspended solids (TSS) concentrations as low as 30 to as high as 800 mg/L, making this system an ideal choice for evaluating the effects of TSS resulting from many activities including simulating low ambient levels of TSS to evaluating sources of suspended sediments from dredging operations, vessel traffic, freshets, and storms.

A robust and flexible flow-through exposure system designed to maintain sediment in suspension is presented. The system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory.

Ein Durchflussbelichtungssystem für die Bewertung Schwebstoffe Auswirkungen auf Leben im Wasser

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Die Bewertung der Wirkung von Umweltchemikalien auf Honig-Bienen-Entwicklung von der Person zu Colony Ebene

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersion von Nanomaterialien in wässrigen Medien: zur Protokoll-Optimierung

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

Vorbereitung des DMMTAV und DMDTAV mit DMAV für Umweltanwendungen: Synthese, Reinigung und Bestätigung

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical data that may be used in predictive modelling to forecast evolutionary responses of natural ecosystems to future environmental changes. However, excluding a few exceptional cases, long-term studies are scarce because of logistic difficulties associated with accessing temporal samples. Temporal dynamics are frequently studied in the laboratory or in controlled mesocosm experiments with exceptional studies that reconstruct the evolution of natural populations in the wild.
Here, a standard operating procedure (SOP) is provided to revive or resurrect dormant Daphnia magna, a widespread zooplankton keystone species in aquatic ecosystems, to dramatically advance the state-of-the-art longitudinal data collection in natural systems. The field of Resurrection Ecology was defined in 1999 by Kerfoot and co-workers, even though the first attempts at hatching diapausing zooplankton eggs date back to the late 1980s. Since Kerfoot&#39;s seminal paper, the methodology of resurrecting zooplankton species has been increasingly frequently applied, though propagated among laboratories only via direct knowledge transfer. Here, an SOP is described that provides a step-by-step protocol on the practice of resurrecting dormant Daphnia magna eggs.
Two key studies are provided in which the fitness response of resurrected Daphnia magna populations to warming is measured, capitalizing on the ability to study historical and modern populations in the same settings. Finally, the application of next generation sequencing technologies to revived or still dormant stages is discussed. These technologies provide unprecedented power in dissecting the processes and mechanisms of evolution if applied to populations that have experienced changes in selection pressure over time.

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Long-term studies are essential to understanding the process of evolution and the mechanisms of adaptation. Generally, these studies require commitments beyond the life-time of researchers. Here, a powerful method is described that dramatically advances state-of-the-art data collection to generate longitudinal data in natural systems.

Auferstehung des ruhenden Daphnia Magna: Protokoll und Anwendungen

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity testing has been demonstrated. Overall, the sensitivity of the species to toxic compounds is in the range with, or higher than, that of other model species.
This work describes protocols for acute, chronic, and multigenerational bioassays of single and combined stressor effects on N. furzeri. Due to its short maturation time and life-cycle, this vertebrate model allows the study of endpoints such as maturation time and fecundity within four months. Transgenerational full life-cycle exposure trials can be performed in as little as 8 months. Since this species produces eggs that are drought-resistant and remain viable for years, the on-site culture of the species is not needed but individuals can be recruited when required. The protocols are designed to measure life-history traits (mortality, growth, fecundity, weight) and critical thermal maximum.

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

In this work, we describe an acute, chronic and multigenerational bioassay to study the effects of single and combined stressors on the Turquoise killifish Nothobranchius furzeri. This protocol is designed to study life-history traits (mortality, growth, fecundity, weight) and critical thermal maximum.

Protokoll für akute und chronische Ökotoxizität Prüfung von Türkis Killifische Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindikation Prüfung von Stream Umwelt Eignung für junge Süßwasser Perle Miesmuscheln mit In Situ Belichtungsmethoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Methods Article

Entwicklung und Prüfung artspezifischer quantitativer PCR-Assays für Umwelt-DNA-Anwendungen