Dieses Protokoll bietet einen hohen Durchsatz und eine zuverlässige Zusammensetzung für die NHEJ-Analyse, die die Prävalenz und relative Menge von Indel-Mutationen in geneditierten Mückenpopulationen bestimmen kann. Im Vergleich zur nächsten Generation oder Sanger-Sequenzierung hat ddPCR eine schnellere Durchlaufzeit für Ergebnisse, was eine schnelle und vollständige Analyse der genetischen Variation für gentechnisch veränderte Organismen ermöglicht. Diese Methode sollte allgemein auf alle experimentellen Systeme anwendbar sein.
Das Verfahren wird Thai Pham, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter des Yang-Labors, demonstrieren. Bereiten Sie zunächst 25 Mikroliter der digitalen Tröpfchen-PCR oder ddPCR-Probenmischung vor, indem Sie ddPCR-Supermix, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, HEX- oder FAM-Sonden, DNA und Wasser in den im Text beschriebenen Proportionen hinzufügen. Mischen Sie dann die Reaktion gründlich durch Vortexing.
Laden Sie mit einer 50-Mikroliter-Mehrkanalpipette 20 Mikroliter der ddPCR-Probenmischung in die mittlere Reihe der Kartusche. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Mehrkanalpipette, um 70 Mikroliter des Öls in die untere Reihe zu laden, ohne Blasen in der gesamten Pipette zu erzeugen. Platzieren Sie die Dichtung, berühren Sie nur die Kanten, vermeiden Sie den mittleren, konkavierten Bereich, und legen Sie dann die Platte sicher in den Tröpfchengenerator und schließen Sie die Abdeckung, um den Lauf zu starten.
Um die Tauchmischung von der oberen Reihe der Kartusche in die 96-Well-Platte zu übertragen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und lassen Sie 40 Mikroliter flüssige Probe für drei bis fünf Sekunden in einem Winkel von 30 bis 45 Grad fallen. Dann stoßen Sie die Mischung langsam für mehr als drei Sekunden in einem Winkel von 45 Grad in den Brunnen aus, so dass sie von der Seite herunterfallen kann, und gehen Sie dann zum zweiten Stopp der Pipette, um die Flüssigkeit vollständig auszustoßen. Mit Folien-Heißsiegeln versiegeln Sie die Platten fünf Sekunden lang bei 180 Grad Celsius.
Legen Sie die versiegelte Platte in den Thermocycler und stellen Sie die PCR-Bedingungen für NHEJ-Drop-off-Richtlinien ein, indem Sie die anfängliche Denaturierung für 10 Minuten auf 95 Grad Celsius einstellen. Dann stellen Sie 40 Zyklen von 94 Grad Celsius für 30 Sekunden ein, um zu denaturieren, 55 Grad Celsius von einer Minute bis zum Glühen und 60 Grad Celsius für zwei Minuten, um sich zu verlängern. Nach 40 Zyklen halten Sie den Halt für 10 Minuten auf 98 Grad Celsius und den endgültigen Halt bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie für alle Schritte eine Rampenrate von zwei Grad Celsius pro Sekunde. Die Glühtemperatur variiert je nach verwendeten Fühlern oder Primer. Legen Sie die Platte sicher in den Tröpfchenleser, wobei der A1 gut oben links beschriftet ist.
Öffnen Sie das Programm und richten Sie die Platte ein, indem Sie FAM als bekannten Referenzkanal und HEX als den unbekannten für jede Vertiefung festlegen. Ändern Sie dann den Namen für jedes Beispiel. Führen Sie das Droplet-Leseexperiment als direkte Quantifizierung aus, während Sie die Vorlage speichern.
Bestimmen Sie die richtigen experimentellen Parameter für die Softwareanalyse, nämlich Probeninformationen, Supermix, Zielname, Zieltyp, Signalkanal eins und Kanal zwei. Legen Sie dann den Schwellenwert für die Tröpfchenzahl über 10.000 fest, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Überprüfen Sie als Nächstes die Anzahl der Tröpfchen für jede Vertiefung in der Tröpfchenregisterkarte und stellen Sie sicher, dass alle über 10.000 liegen.
Überprüfen Sie schließlich die 1D-Amplitude auf eine effiziente Signaltrennung von Negativen. Markieren Sie im Platteneditor die gesamte Platte, und legen Sie fest, dass der Experimenttyp abfällt. Legen Sie das WT-Ziel als Referenz fest und legen Sie Kanal eins für FAM und Kanal zwei für HEX fest.
Legen Sie das NHEJ-Ziel als unbekannt fest, und legen Sie Kanal eins für FAM und Kanal zwei als keinen fest. Legen Sie auf der Registerkarte 2D-Amplitude die Clusterschwellenwerte mit den Diagrammwerkzeugen für jede Probe fest. Der Schwanz ist normalerweise mit dem WT-Cluster für NHEJ-Assays assoziiert.
Klicken Sie auf der Registerkarte Übersetzung auf das Zahnradsymbol oben rechts im Diagramm und wählen Sie die gebrochene Häufigkeit aus, um einen Punkt darzustellen, der dem Prozentsatz der NHEJ-Ereignisse entspricht. 15 verschiedene gezogene Proben von jeweils 10 Moskitos enthielten verschiedene NHEJ-Allele, wurden mit dem Drop-off-Assay analysiert und identifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass alle 15 Proben 100% Indel-Allele trugen. In einem anderen Experiment wurden 11 gezogene Proben von Wildtypmücken und NHEJ-Mücken mit unterschiedlichen NHEJ-Prozentsätzen mit diesem ddPCR-Protokoll untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass der identifizierte Prozentsatz vergleichsweise nahe an der Indel-Detektion durch Amplikon-Analysetechnik lag. Pipettieren Sie langsam, um Blasen zu vermeiden, und lassen Sie alle emulgierten Tröpfchen die Wand der Vertiefungen hinuntertropfen.
