Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Systems, das Effizient Biomoleküle für eine Vielzahl von Forschungs- und zellbasierten therapeutischen Anwendungen liefern kann. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass es eine schnelle Abgabe von Biomolekülen an Zellen ermöglicht und gleichzeitig ihre Lebensfähigkeit beibehält. Es handelt sich um eine Plattformtechnologie, mit der Zellen für eine Vielzahl von zelltherapeutischen Anwendungen wie die Krebsbehandlung transformiert werden können.
Beginnen Sie mit der Kombination von 54 Gramm PDMS-Basis und sechs Gramm Härter in einer Tasse. Mindestens eine Minute lang kräftig und gründlich mit einem Spatel mischen, dann die Tasse mit der PDMS-Lösung für ca. 30 Minuten in einen Trockenlufter geben oder bis die verbleibenden Luftblasen entfernt sind. Legen Sie einen fotolackbeschichteten Wafer mit den nach oben gerichteten Mustern in eine 150-Millimeter-Petrischale und gießen Sie dann die PDMS-Lösung über die Form.
Legen Sie die Petrischale bei Bedarf in einen Trockenluft und wenden Sie Vakuum an, bis die verbleibenden Luftblasen verschwinden. Die Petrischale in einen Laborofen geben und zwei Stunden bei 60 Grad Celsius backen, um das PDMS auszuhärten. Entfernen Sie nach dem Aushärten vorsichtig das PDMS aus der Petrischale, indem Sie die Ränder des Wafers mit einer Rasierklinge umschneiden.
Schneiden Sie jedes einzelne Gerät mit einem Messer oder einer Rasierklinge aus und stanzen Sie dann mit einem 2,5-Millimeter-Biopsiestempel Löcher durch die Ein- und Auslassöffnungen. Nachdem Sie das PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma behandelt haben, legen Sie jedes Gerät sofort auf einen sauberen Kalknatronglasobjektträger mit Kanälen, die der Glasoberfläche zugewandt sind. Lassen Sie die Geräte über Nacht bei Raumtemperatur verkleben.
Tragen Sie Silikon vorsichtig mit einer Dicke von einem bis zwei Millimetern auf die Oberfläche des Piezoaufnehmers mit einem Zentimeter Durchmesser auf, dann den Wandler vorsichtig mit einer konzentrischen Spirale ausrichten und vorsichtig auf den Boden des Glasmikroskopobjektträgers drücken. Schließen Sie einen Mikrocontroller über ein USB-A-zu-B-Kabel an einen Computer an. Eine grüne Led-Betriebsanzeige sollte aufleuchten.
Verwenden Sie die zugehörige Software auf dem Computer, um ein Programm hochzuladen, das ein Acht-Megahertz-Signal erzeugt. Löten Sie einen 22-Zoll-Draht an das Ende jedes Drahtes auf dem PZT-Wandler. Verwenden Sie es dann, um das Negativepolkabel des PZT-Wandlers mit einem GND-Pin zu verbinden.
Verbinden Sie den Pluspoldraht des PZT-Wandlers über den lötbaren Draht mit dem Ausgangspin. Schneiden Sie drei bis sechs Zoll Abschnitte aus Tygon-PVC-Weichplastikschläuchen und schieben Sie den Schlauch in die Ein- und Auslassöffnungen. Es kann notwendig sein, den Schlauch beim Ausüben von Druck zu drehen, bis er in die Öffnung passt.
Optional kann an der Verbindung Klebstoff aufgetragen werden, um PDMS und Schlauch miteinander zu verbinden. Optional montieren Sie das akustofluidische Gerät und den Mikrocontroller in einem 3D-gedruckten Gehäuse. Montieren Sie das mikrofluidische Reservoir gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Schneiden Sie einen Drei- bis Sechs-Zoll-Abschnitt aus 1/16 Zoll Innendurchmesser Tygon PVC-Weichkunststoffschlauch und schieben Sie ihn über den 1/32 Zoll Innendurchmesser Schlauch aus dem mikrofluidischen Reservoirausgang. Optional wickeln Sie die Verbindung mit Paraffinfolie um, um ein Auslaufen zu verhindern. Füllen Sie eine 60-Milliliter-Spritze mit Umgebungsluft an der Seite des mikrofluidischen Reservoirs.
Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Rate von 200 Millilitern pro Stunde ein, um die Kontrastmittellösungen mit einem Volumenstrom von 50 Millilitern pro Stunde durch das akustofluidische Gerät zu drücken, und sammeln Sie die Proben vom Ausgang des Geräts in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Bereiten Sie eine Phopholipidlösung in einer 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen vor, indem Sie 25 Milligramm DSPC, 11,6 Milligramm DSEPC, 0,26 Milligramm DSPG und 0,88 Milligramm Polyoxyethylen40-Stearat hinzufügen. Chloroform hinzufügen, bis alle Phospholipide gelöst sind.
Chloroform in einem Dichtmittel 48 Stunden lang verdampfen, um einen trockenen Lipidfilm zu bilden. Rehydrieren Sie den Schaum mit 10 Millilitern sterilem PBS und beschallen Sie dann die Lipidlösung drei Minuten lang bei 40% Amplitude, um eine kationische mizellare Lösung zu bilden. Nach der Beschallung kann die Phopholipidlösung bei zwei bis sechs Grad Celsius bis zu einem Monat gelagert werden.
Um Ultraschallkontrastmittel vorzubereiten, fügen Sie 200 Mikroliter kationische mizellare Lösung in 600 Mikroliter sterilem PBS zu einer zwei Milliliter Glasseptum-Durchstechflasche hinzu. Verschließen Sie die Durchstechflasche, indem Sie die Kappe crimpen. Verwenden Sie eine 1,5-Zoll-Nadel mit 20 Gauge, um den Kopfraum der Durchstechflasche 30 Sekunden lang mit Decafluorbutangas zu füllen.
Amalgamieren Sie die Durchstechflasche zu perfluorbutangasgefüllten Ultraschallkontrastmitteln. Fügen Sie 25 Mikroliter Ultraschall-Kontrastmittellösung pro Milliliter Zelllösung hinzu. Anschließend pumpen Sie sofort das kombinierte Kontrastmittel und die Zellmischung durch das akustofluidische Gerät.
Dieses Protokoll erzeugt ein akustofluidisches System, das verwendet werden kann, um die intrazelluläre molekulare Abgabe in mehreren Zelllinien zu verbessern. Die intrazelluläre Abgabe einer fluoreszierenden Verbindung, Fluorescein, an primäre menschliche T-Zellen wurde mit akustofluidischer Behandlung im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollgruppe verbessert. Die Fluoreszenzintensität der T-Zellen erhöhte sich nach der Behandlung um das Fünffache, was auf eine verbesserte Abgabe von Fluoreszein hindeutet.
Die Zelllebensfähigkeit nahm nach einer akustofluidischen Behandlung leicht ab, blieb aber über 80% Die akustofluidische Behandlung verbesserte die intrazelluläre Abgabe einer konservierungsmittelhaltigen Verbindung Trehalose an menschliche A549-Lungenkarzinomzellen im Vergleich zum Fluss allein und zu Zellen in der unbehandelten Kontrollgruppe. Das Hinzufügen der kationischen Mikroblasen zur Zelllösung ist von entscheidender Bedeutung. Die intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen wird ohne kationische Mikroblasen in Lösung begrenzt.
Diese Plattform ermöglicht die intrazelluläre Verabreichung verschiedener Biomoleküle, die die Zellfunktion für Forschungs- oder therapeutische Zwecke verändern können. Nach Abschluss dieses Verfahrens kann eine zusätzliche zelluläre Charakterisierung durchgeführt werden, um die Auswirkungen der Abgabe verschiedener Biomoleküle zu bewerten.
