Diese Methode kann verwendet werden, um regulatorische Elemente zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Translation während der Eizellreifung steuern. Wir haben zeitraffermikroskopisch angewendet, um die Akkumulation von Reportern während der In-vitro-Eizellreifung zu beurteilen. Dies zeigt genau den Zeitpunkt, zu dem die translationale Aktivierung oder Repression während der Eizellreifung stattfindet.
Öffnen Sie zunächst vorsichtig die Antralfollikel, indem Sie mit einer 26-Gauge-Nadel einen kleinen Schnitt in der Follikelwand machen. Isolieren Sie intakte COCs mit mehreren Schichten von Kumuluszellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette. Verwenden Sie eine kleinere Pipette und entkernen Sie die COCs mechanisch durch wiederholtes Pipettieren.
Saugen Sie die entsäten Eizellen an und legen Sie sie in eine Petrischale mit Einem Reifungsmedium, das mit einem Mikromolar Cilostamid ergänzt wird. Stellen Sie die Schale für zwei Stunden in einen Inkubator, damit sich die Eizellen von dem Stress erholen können, der durch ihre Isolierung von den Follikeln verursacht wird. Legen Sie ein 10 Zentimeter langes Kapillarrohr aus Borosilikatglas in einen mechanischen Puller, um Injektionsnadeln vorzubereiten.
Biegen Sie die Nadelspitze in einem Winkel von 45 Grad mit einem beheizten Filament für eine optimale Injektion. 20 MikroliterTröpfchen des basischen Eizellensammelmediums in eine Polystyrolschale geben und die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl bedecken. Bereiten Sie ein größeres Volumen an Reportermischung vor, indem Sie jeweils 12,5 Mikrogramm pro Mikroliter Ypet UTR und mCherry hinzufügen.
Lagern Sie Aliquoten davon bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie das Aliquot zwei Minuten lang bei 20.000 mal G und geben Es dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen über. Laden Sie die Injektionsnadel mit ca. 0,5 Mikrolitern Reportermischung auf.
Legen Sie die Haltepipette und die Injektionsnadel in die Halter und positionieren Sie sie im Tröpfchen des Eizellensammelmediums. Öffnen Sie die Injektionsnadel, indem Sie sie vorsichtig gegen die Haltepipette klopfen. Legen Sie die Eizellen in ein Tröpfchen aus basischem Sammelmedium und injizieren Sie fünf bis 10 Pikoliter der Reportermischung.
Inkubieren Sie die Eizellen und das Reifemedium mit einem mikromolaren Cilostamid für 16 Stunden, damit das mCherry-Signal ein Plateau erreicht. Bereiten Sie für die Zeitraffermikroskopie eine Petrischale mit zwei 20-Mikroliter-Tröpfchen Reifemedium für jeden injizierten Reporter, einem Tröpfchen mit einem mikromolaren Cilostamid zur Kontrolle von ProphaseN-I-arrestierten Eizellen und einem Tröpfchen ohne Cilostamid zur Reifung von Eizellen vor. Decken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl ab und legen Sie sie in den Inkubator.
Nach der Vorinkubation die injizierten Eizellen aus dem Inkubator entfernen und viermal im Reifemedium ohne Cilostamid waschen. Halten Sie einige Eizellen im Reifemedium mit einem mikromolaren Cilostamid als Prophase-I-Eizellkontrollgruppe. Übertragen Sie die injizierten Eizellen auf ihre jeweiligen Tröpfchen auf der zuvor vorbereiteten Zeitraffermikroskopschale.
Gruppieren Sie die Eizellen mit einer geschlossenen Glaspipette, um ihre Bewegung während der Aufnahme zu verhindern. Stellen Sie die Schüssel unter das Mikroskop, das mit einem Leuchtdiodeneliminationssystem und einer motorisierten Stufe ausgestattet ist, die mit einer Umweltkammer ausgestattet ist, die bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gehalten wird, wobei die im Textmanuskript genannten Parameter verwendet werden. Geben Sie die entsprechenden Einstellungen für das Zeitrafferexperiment ein, indem Sie auf Apps und dann auf Multidimensionale Erfassung klicken.
Wählen Sie die erste Registerkarte Haupt und dann Zeitraffer, mehrere Stufenpositionen und mehrere Wellenlängen aus. Wählen Sie die Registerkarte Speichern, um den Speicherort des Experiments einzugeben. Wählen Sie dann die Registerkarte Zeitraffer, um die Anzahl der Zeitpunkte, die Dauer und das Zeitintervall einzugeben.
Wählen Sie die Registerkarte Bühne, schalten Sie das Hellfeld ein und suchen Sie die Position der Eizellen, indem Sie ein neues Fenster öffnen und Erfassen, Erfassen und Live anzeigen auswählen. Sobald die Eizellen lokalisiert sind, wechseln Sie zurück zum mehrdimensionalen Erfassungsfenster und drücken Sie Plus, um die Position der Eizellen einzustellen. Wählen Sie die Registerkarte Wellenlängen und legen Sie drei verschiedene Wellenlängen für Hellfeld, YFP und mCherry fest.
Passen Sie die Belichtung für Ypet und mCherry an und starten Sie dann das Zeitrafferexperiment, indem Sie auf Acquire klicken. Für die Analyse der Ypet drei Prime UTR Translation, führen Sie zwei Regionenmessungen für jede Eizelle durch, die Eizelle selbst durch Klicken auf Ellipsenregion und eine kleine Region, die die Eizelle umgibt, um für die Hintergrundsubtraktion verwendet zu werden, indem Sie auf rechteckige Region klicken. Exportieren Sie die Regionsmessdaten in eine Tabelle, indem Sie auf Protokoll öffnen und dann auf Protokolldaten klicken.
Subtrahieren Sie für jede einzelne Eizelle und für alle gemessenen Zeitpunkte die Hintergrundbereichsmessung von der Eizellbereichsmessung getrennt für YFP- und mCherry-Wellenlängen. Die Expression von mCherry und YFP in Prophase I und reifenden Eizellen wurde in 39 Eizellen aufgezeichnet, von denen 30 gereift waren und neun in Prophase I als Negativkontrolle gestoppt wurden. Individuelle YFP-zu-mCherry-Verhältnisse für Signale von Prophase I-arrestierten und reifenden Eizellen wurden für das injizierte Volumen korrigiert, indem das YFP-Signal durch das durchschnittliche mCherry-Signal der letzten 10 Zeitpunkte für prophase I-arrestierte und reifende Eizellen geteilt wurde.
Die Translationsraten des Reporter-YFP wurden durch Kurve gemessen, die das Verhältnis von YFP zu mCherry in Prophase I und in reifenden Eizellen während der ersten null bis zwei Stunden oder acht bis 10 Stunden nach der Freisetzung von Cilostamid mittels linearer Regression anpassen. Die Akkumulation des Reporters folgt keinem linearen Muster, wie ein signifikanter Unterschied in den Translationsraten zwischen null bis zwei Stunden und acht bis 10 Stunden nach der Freisetzung von Cilostamid zeigt, was auf eine Aktivierung der Interleukin-7-Translation während der myotischen Reifung der Eizellen hinweist. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit zu Beginn der Aufnahme ausreichend ist.
Denken Sie daran, dass das Signal während des Zeitverlaufs sättigen kann, wenn die Translation während der wiederaufnahme der Eizellmion aktiviert wird. Die Stabilität des MRMA kann durch PCR unter Verwendung von Primern für YFP bestätigt werden. Um Änderungen in der Übersetzung zu bestätigen, können Sie Western Blotting mit einem Antikörper gegen eine V5-Technologie verwenden.
