die mRNA-Elektroporation ermöglicht eine schnelle, effiziente und räumlich und zeitlich gesteuerte Expression mehrerer Proteine innerhalb des Aviären Modellsystems. Diese Methode ermöglicht eine breitere und schnellere Expression fluoreszierender Proteine als die Durch standard-DNA-Elektroporation erreichte Kennzeichnung. Elektroporation erleichtert die transiente Öffnung von Poren in der Plasmamembran, die als Leitungen für die Übertragung von genetischen Nutzlasten wie RNA und DNA in die Zellen zahlreicher Modellorganismen dienen.
Für die ersten Experimente arbeiten mit Embryonen, die älter als einen Tag alt sind, da sie härter und resistenter gegen externe Manipulationen wie Elektroporation sind. Im entsprechenden embryonalen Entwicklungsstadium vorsichtig brechen und den Wachteleiinhalt in eine 10 Zentimeter lange Petrischale gießen. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Großteil des dicken Albumens zu entfernen.
Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Oberfläche des Jochs sanft abzuwischen, um das verbleibende dicke Album um den Embryo zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Embryo fest am Papierring klebt. Legen Sie vorgeschnittenes Filterpapier über den Embryo und verwenden Sie eine Schere, um den Umfang des Embryos sanft zu schneiden. Verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um PPS unter dem Embryo mit sanften Strömen zu schichten, um jedes Joch zu räumen, das am Gewebe klebt.
Ziehen Sie den Embryo-Papierring langsam in einem schrägen Winkel nach oben und außerhalb des Jochs. Legen Sie das Papier zur weiteren Reinigung in eine mit PBS gefüllte Petrischale. Sobald der größte Teil des Jochs entfernt wurde, legen Sie die embryoventrale Seite in eine 35 Millimeter Petrischale, die mit einer halbfesten Mischung aus Agar und Albumen bedeckt ist.
Bereiten Sie die Elektroporationskammer vor, indem Sie die schwarze Elektrode mit PBS füllen und den Embryo darin platzieren. Verwenden Sie eine Glasmikrokapillare, um einen Bolus von 200 Nanoliterm mRNA in den Hohlraum zwischen Dem Epiblast und der Vitelline-Membran zu injizieren, die die gewünschte Region abdeckt. Und dann verwenden Sie die rote Elektrode, um den Embryo zu elektroporate.
Den elektropolierten Embryo wieder auf die Agar-Albumen-Mischung legen und bei 38 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium brüten. Zur Abbildung der elektroporationscodierten fluoreszierenden Proteine beobachten Sie alle elektroporated Embryonen unter einem fluoreszierenden Sezierendereoskop, um den gesündesten und besten elektroporated Embryo für die dynamischen bildgebenden Experimente auszuwählen. Die anderen galvanisierte n.A. und nicht-galvanisierte Embryonen in einem separaten Inkubator weiter inkubieren.
Spülen Sie den ausgewählten Embryo kurz mit PBS ab, um Alle Blasen zu entfernen, die sich während der Elektroporation auf der Rückenseite des Embryos gebildet haben könnten. Legen Sie den gereinigten Embryo direkt in eine bildgebende Schale, die eine dünne Schicht von etwa 150 Mikrolitern Albumen-Agar enthält und darauf achtet, keine Blasen auf der dorsalen Oberfläche des Embryos zu erzeugen. Fügen Sie ein kleines feuchtes aufgerolltes Stück Tissuepapier entlang der Innenkanten der bildgebenden Schale hinzu.
Versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie, um die Verdunstung während der Bildgebung und Inkubation zu minimieren. Bewegen Sie die Schale schnell in das vorgewärmte Stadium eines konfokalen Mikroskops und verwenden Sie den Hellfeldkanal, um den farbigen Farbstoff im Embryo zu lokalisieren. Stellen Sie die Bildverarbeitungssoftware auf das gewünschte Objektiv, den dichroitischen Spiegel und die Emissionsspektren ein, und schalten Sie einen geeigneten Laser ein.
Achten Sie darauf, dass die Zellen während des gesamten Films in der Bildsicht bleiben. Verwenden Sie eine ausreichend hohe bildgebende Auflösung, und stellen Sie sicher, dass die bildgebenden Bedingungen keine Phototoxizität verursachen. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Live und passen Sie die Laserleistung an eine Einstellung an, die je nach Mikroskoplaserleistung für die Fluoreszenzintensität geeignet ist.
Beginnen Sie mit der Bildgebung des Embryos mit 1%Laserleistung und einer 800-Verstärkung, wodurch die Laserleistung langsam um 1% erhöht wird, bis gesättigte Pixel zu sehen sind. Wenn gesättigte Pixel beobachtet werden, verringern Sie die Laserleistung leicht, bis keine gesättigten Pixel visualisiert werden können. Stellen Sie den Embryo alle drei bis fünf Minuten vor, um die Migration einzelner Zellen über verschiedene Zeitpunkte mit fünf Mikrometer-Z-Stacks des gesamten galvanischen Bereichs mit etwas zusätzlichem Platz zum Boden des Z-Stacks zu überprüfen, falls der Embryo während der Bildgebungssitzung in das Agarosebett sinkt.
Um zu beobachten, wie schnell sich die Zellen bewegen, überprüfen Sie die ersten Zeitpunkte des ersten Films. Wenn sich die Zellen schnell bewegen, sollten Sie den Zoom des abgebildeten Bereichs erweitern oder einen anderen Bereich bebildern. Wenn der gesamte galvanisierte Bereich des Embryos abgebildet wurde, Bild in nicht elektropneurierten Bereich des gleichen Embryos, um die Autofluoreszenzspiegel zu bestimmen.
Um zu bestimmen, wie lange transfizierte mRNA nach Bestätigung der Elektroporation des Gens auf dem Stereomikroskop in fluoreszierende Proteine übersetzt werden kann, platzieren Sie den Embryo auf einer vorgeheizten Stufe des invertierten konfokalen Mikroskops und verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser mit einer Laserleistung von 70 %, 100 Iterationen und einer Scangeschwindigkeit von vier, um den größten Teil der zellulären Fluoreszenz aus dem galvanischen Gen an einer Vielzahl von Zeitpunkten zu photobleichen. Bebrütet die Embryonen nach dem Photobleichen bei 36 Grad Celsius weiter und befällt darauf, dass die aktiv teilenden Zellen innerhalb des photolleichten Bereichs, die typischerweise nur bei gesunden Embryonen zu sehen sind, darauf achten, dass die Elektroporation den embryonalen Zellen nicht geschadet hat. Erfassen Sie postbleichen Z-Stack-Bilder des galvanischen Bereichs für eine gewünschte Zeitdauer in regelmäßigen Zeitintervallen von drei bis fünf Minuten.
Um sicherzustellen, dass die bildgebenden Bedingungen das Überleben des Embryos nicht schädlich beeinträchtigen, brütet gleichzeitig galvanisierte Embryonen, die nicht photobleached sind, um als Kontrolle für die Bildgebung zu dienen. Um die Photobleichergebnisse für den mRNA-Zerfall nach der Elektroporation zu quantifizieren, verwenden Sie ImageJ, um die Fluoreszenzintensität eines 7,5-Mikrometer-Kreises in der Mitte des galvanischen Bereichs jeder Zelle zu messen, um die Zellfluoreszenz über jedes Drei- bis Fünf-Minuten-Intervall zu verfolgen. Wenn alle Zellen innerhalb der photogebleichten Region, die sich keiner Mitose unterziehen und vollständig photobleached sind, gemessen wurden, zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit nach der Bleiche zu jedem der Zeitpunkte, an denen der Embryo photobleached wurde.
Obwohl die DNA-Elektroporation in einigen galvanivernierten Zellen zu einer helleren Fluoreszenz führt, ist die Effizienz der DNA-Elektroporation im Vergleich zu den weit exprimierten mRNA-kodierten fluoreszierenden Proteinen sichtbar geringer. Beim Vergleich von DNA und mRNA-Ko-Elektroporation innerhalb desselben Embryos ist die DNA-Expression fluoreszierender Proteineffizienz ebenfalls signifikant und konsistent weniger effizient als die der mRNA, die fluoreszierendes Protein exezieren. Die Quantifizierung aller Embryonen, die nur mit mRNA, DNA oder einer Kombination aus beiden galvanisierte, zeigt, dass mRNA etwa 75 % der Zellen in einer bestimmten Region transfekt, während die DNA nur etwa 25 % der Zellen transfekt.
Die transfizierte mRNA sollte zu einer schnelleren Proteinproduktion im Vergleich zu transfizierter DNA führen, da die mRNA sofort von zytosolischen Translationsmaschinen erkannt werden kann. Obwohl sich die Ko-Elektroporation mehrerer DNAs bisher als relativ ineffizient erwiesen hat, führte die Ko-Elektroporation von vier mRNAs in diesem Experiment zu einer Transfektionseffizienz von 87 % aller vier mRNAs in allen galvanierten Regionen. Obwohl photobleaching zunächst die Fluoreszenzintensität in den photobleached Zellen um etwa 95% reduziert, bleiben einige Zellen übrig, die ihre Fähigkeit, fluoreszierende Proteine kurz nach der Elektroporation zu teilen und auszudrücken, wiederherstellen.
Diese Fähigkeit nimmt jedoch über fünf Stunden nach der Elektroporation ab. Nehmen Sie sich Zeit, die besten Bildgebungsbedingungen zu optimieren und basteln Sie weiter, auch nachdem der Film bei Bedarf bereit ist, Anpassungen vorzunehmen.
