Wir möchten Changhui Pak und Alysia Vrailas Mortimer bedanken für den Unterricht zunächst SMK Gehirn Dissektion Technik. Wir danken auch Mitglieder des Ken Mobergs Lab-Gruppe, vor allem Chris Runden für das Manuskript kritisch zu lesen. Antikörper erkennen Fas2 (1-4) und Chaoptin (24B10) stammen aus der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank. Antikörper-24B10 wurde auf die DSHB durch Seymour Benzer und Nansi Colley24,60,61eingezahlt, Antikörper 1 4 war, die DSHB von Corey Goodman 22,23,56hinterlegt. Fliegende-Aktien wurden von Bloomington Stock Center erhalten. Wir möchten auch danke dem Ohio Agricultural Research und Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center für den Einsatz des konfokalen Mikroskops Gehirne in Abbildung 4A Image und B. SMK wird unterstützt durch einen Zuschuss von NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die Dissektion und Visualisierung der oben beschriebene Methode kann in einer Vielzahl von Immunostaining verwendet werden und live imaging-Anwendungen. Wir haben eine allgemeine Immunostaining Protokoll beschrieben und haben deutlich gemacht, dass eine Art und Weise MARCM axonalen Morphologie der einzelnen Pilz Körper Nervenzellen visualisieren verwendet werden kann. Darüber hinaus diese allgemeine Verfahren können auch verwendet werden, für andere Hirnregionen in festen imaging oder frisch seziert Erwachsenen Gehirne48,65. Live Imaging können ein effizienteres Vorgehen bei der Analyse der Expressionsmuster von Enhancer fallen, Reporter-Gene oder mimischen Linien66, zum Beispiel. Um zu verhindern, dass erfassen Artefakte von Zelltod während der live Aufnahme der GLP in fixierten Gewebe, Gehirne sollten werden zerlegt in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder HL3 Medien48, montiert auf Brücke Folien in 1 x PBS (oder HL3) und abgebildet in weniger als 15-20 min. Pflege auch achten so viel Luftröhre möglichst aus dem seziert Gehirn vor Bildgebung, zu entfernen, da es mit Visualisierung der GFP Fluoreszenz stören kann.
Während Färbung Bedingungen für die Beurteilung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen relativ gut etablierte24,61,67, die Lokalisierung eines spezifischen Proteins des Interesses an dieser Zelle sind Typen erfordern umfangreiche Fehlerbehebung und Optimierung. Insbesondere sollte einige wichtige Schritte, einschließlich Antikörper Verdünnung, blockierende Puffer Komponente Konzentration und Fixierung, optimiert werden, um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu generieren. Zunächst sollte die optimale Konzentration der primären Antikörper bestimmt werden. Obwohl im Handel erhältlichen Antikörper oft eine empfohlene Verdünnung haben (und wir oft erst beginnen durch den Einsatz dieser Konzentration), sind diese Werte auf Drosophila Gewebe selten empirisch ermittelt. Daher testen eine Reihe von primären Antikörper-Verdünnungen, der Bereich oberhalb und unterhalb des Herstellers ab Vorschlag oft spezifische Färbung führt. Während Primärantikörper Verdünnung kann erhebliche Auswirkungen auf die Färbung Genauigkeit und sollte genau bestimmt werden, die Zeit Gehirne im primären Antikörper enthaltenden ausgebrütet werden können Lösungen mit wenig Einfluss auf das Gesamtergebnis erheblich variieren. Zum Beispiel haben wir ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn Inkubation Gehirne mit den Fas2 Antikörper Primärantikörper für zwei, drei oder sogar vier Tage bei 4 ° c seziert Zwar wir mindestens zwei Nächte empfehlen, haben wir auch Gehirne in Primärantikörper Lösung für eine einzige Nacht inkubiert und reproduzierbare Färbung erhalten. Wichtiger ist, hilft die Begrenzung der Höhe der Zeit, die Gehirne in der sekundären Antikörper zu 3 h bei Raumtemperatur (oder eine Nacht bei 4 ° C) inkubiert werden Grenze unspezifische Bindung der Sekundärantikörper, Hirngewebe.
Zweitens kann es notwendig, zusätzliche "Sperrung" Reagenzien zu verwenden, um unerwünschte Hintergrundgeräusche Signal zu beseitigen sein. Erhöhung der Konzentration von NGS auf ~ 10 %, 1-10 % Bovine Serum Albumin (BSA) hinzufügen, die Sperrung und primäre/sekundäre Antikörper Lösungen oder Pre-Adsorption von primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C mit Drosophila Embryos (siehe Optionen Referenz-68, Abschnitt 2.9, Schritt 3).
Während wir das obige Protokoll mit PTN als den vorgeschlagenen Puffer für alle Fixierung geschrieben haben, führen waschen, und Antikörper Inkubationsschritte, Gewebe Fixierung in anderen Puffer (z. B. PLP und PEM, aufgeführt in der Materialtabelle) tiefgreifende Unterschiede in Signalstärke. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass Cyclin E ist nicht nachweisbar im Larvenstadium imaginalen Scheiben, wenn Gewebe im traditionellen 4 % Paraformaldehyd in PBS verdünnt behoben werden, aber ist deutlich sichtbar, wenn Gewebe im PLP Puffer (Ken Moberg, persönliche behoben werden Kommunikation und Referenz-69). Neben Änderungen im Puffer Komponenten, Änderung der Zeit und Temperatur für Gewebe Fixierung auch erheblich immunofluorescent beeinträchtigen kann beflecken und kann bei Bedarf empirisch ermittelt werden. In der Regel Fixierzeit sollte lang genug sein, für ausreichende Vernetzung von Zellkomponenten ermöglichen und langfristige Erhaltung der gesamten zellulären Morphologie während begrenzt genug, um über Vernetzung und "vergraben" von Protein Epitope zu verhindern. Daher beim zunächst Färbung Bedingungen für einen neu erworbenen Primärantikörper optimieren wir in der Regel Fixierzeit ca. 20 min zu begrenzen und behebt oft Gewebe bei kälteren Temperaturen.
Mehrere Steuerelemente sollten in jedem Immunfluoreszenz-Experiment zu untersuchen, die Spezifität der primären und sekundären Antikörper sowie die Wirkung der transgene/genetische Herkunft auf den beobachteten Phänotyp aufgenommen werden. Um festzustellen, ob der primäre Antikörper speziell verwendet wird das Protein des Interesses erkennt, sollte Gewebe von den fliegen fehlt dieses Protein und/oder des Gewebes, die das Protein überexprimiert als Steuerelemente enthalten sein. Die Zugabe von überschüssige gereinigte Antigen Protein kann auch aufgenommen werden, um festzustellen, ob der primäre Antikörper andere Epitope im Gehirn Fliege erkennt. Schließlich stellt jeder Fluoreszenzsignal anwesend, als primären Antikörper entfallen das Niveau der unspezifischen Bindung durch die ausgewählten sekundäre Antikörper.
Mehrere wichtige Steuerelemente sollten auch aufgenommen werden, um den Beitrag der genetische Hintergrund oder das Vorhandensein von transgenen Färbung Intensität oder neuronale Morphologie zu beurteilen. Beispielsweise enthalten die fliegen in die MARCM Experiment in Abbildung 5 verwendet mehrere transgene (HsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Wanne &#62; GAL80 und OK107-GAL4), von denen jeder für Auswirkungen auf die Morphologie der Pilze Körper getrennt analysiert werden sollte. Auf ein absolutes minimum, Pilz Körper Morphologie von fliegen sollten mit OK107-GAL4 und UAS-CD8-GFP analysiert werden. Es kann auch erforderlich sein, die Wirkung der Hitzeschock und Flp Rekombinase Produktion auf Pilz Karosserieentwicklung Dateientyp fliegt mit HsFLP und FRT82B. Obwohl MARCM erhebliche Einblick bieten, ob ein gegebenen Proteins autonom axonalen Führung steuert, kann die Anzahl der Kontrollen erforderlich, um genau diese Schlussfolgerung machen eine kleine Einschränkung dieser Technik sein. In weniger komplizierten Experimente gelten ähnliche Kontrollen auch. Zum Beispiel nehmen Sie ein Experiment, wo ist die GAL4/UAS -System in Kombination mit einer RNAi-Transgen Knockdown Ausdruck eines Proteins des Interesses an alle Neuronen verwendet wird. In diesem Experiment werden mindestens zwei transgene anwesend: eine Pfanne neuronalen GAL4-Treiber z. B. Ilav-GAL4 und UAS-RNAi -Transgen. Die Morphologie der Pilze Körper Neuronen im fliegen, enthält jeder der diese transgene allein sollte neben der Versuchsbedingung untersucht werden, wo fliegen beide transgene in der gleichen Fliege beherbergen.
Schließlich, um festzustellen, ob das Protein des Interesses in Pilz Körper Neuronen zum Ausdruck kommt ist es normalerweise notwendig, Co Fleck Gehirne mit Antikörpern gegen Fas2. Fluoreszierende Proteine wie z. B. GFP, RFP oder die Membran gebunden CD8-GFP können alternativ auch ausgedrückt werden, verwenden das GAL4/UAS -System und in Kombination mit Antikörpern, die das Protein des Interesses zu erkennen. Fas2 erkennt nur die fasciculated Axone, die die Pilz Körper α und β-Lappen zu bilden, seit die Verwendung von GAL4-driven, Membrane-springen CD8-GFP besonders nützlich für die Kennzeichnung von Pilz Körper Neuronen.
Mängel bei der axonalen Beratung sind oft nicht 100 % Penetranz und sogar Gehirne des gleichen Genotyps können gewisse Variabilität zeigen. Daher, wenn mutierten Allele für Mängel in Pilz oder Photorezeptor Pathfinding Analyse neu generiert werden, sollte eine Kombination aus verschiedenen Allelen und Ansätze genutzt werden. Die meisten Studien in der Literatur verschiedene Ansätze um zu untersuchen, ob ein Protein eine Zelle-autonome Rolle bei der Kontrolle der axonalen Anleitung verwenden: ich) Analyse der Pfadfindung Mängel bei homozygot null fliegen (vorzugsweise mit verschiedenen Null-Allele), Ii) Analyse der Pfadfindung Mängel an fliegen fehlt das Protein des Interesses nur in Neuronen (in der Regel über RNAi), Iii) MARCM Analyse der Pfadfindung Mängel und iv) Experimente, wo das Gen erneut zum Ausdruck in den Neuronen der homozygot Null ist, zu retten fliegt. Im Idealfall sollten mehrere Dutzend Köpfe pro Genotyp für Mängel in neuronale Morphologie analysiert werden.
Obwohl das Protokoll hier in erster Linie konzentriert sich auf immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen innerhalb fixierte Gewebe beschrieben, werden mehrere zukünftige Anwendungen dieser Technik zum Bild live Hirngewebe entwickelt. Gehirn (in der Regel in Zellkulturmedien) seziert werden, kann sie dann kultiviert für mehrere Tage bei 25 ° c Diese ex Vivo Kultivierung Methoden entwickelt, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen, wie z. B. Proteinaktivität zu untersuchen, das Axon Regeneration nach Verletzungen70,71, intrazelluläre fördert Signalisierung Dynamik72und neuronale Entwicklung73.

Zwar das Nervensystem Drosophila kleiner als die von Menschen und Nagern, stellt seine Komplexität ein kraftvoll, ansprechbar Modell zum besseren Verständnis seiner fest gefügten Pendants. In vielen Fällen kodieren das Genom der Wirbeltiere und fliegt sehr ähnliche Proteine, die die Mechanismen der Entwicklung des Nervensystems zu diktieren. In der Tat erforderlich viele der Gene, für die neuronale Entwicklung bei Wirbeltieren Orthologe in fliegen, einschließlich derjenigen Signalwege, dass Kontrolle Musterung, Neurogenese und axonalen Anleitung1,2,3 beteiligt haben ,4,5. Netrin ist beispielsweise ein Ligand für axonalen Beratung bei Säugetieren und D. Melanogaster6,7,8erforderlich. Während Netrin von embryonalen Küken Gehirn Gewebe6ursprünglich isoliert war, haben nachfolgende Studien gezeigt, dass Netrin spielt eine erhaltene Rolle während der Entwicklung des embryonalen zentrale Nervensystem (ZNS) in Drosophila8. Andere Studien haben genetische Bildschirme in der embryonalen Drosophila CNS zum konservierten Liganden und Rezeptoren für Pathfinding in Drosophila und Wirbeltieren9erforderlichen identifizieren.
Während die embryonale Fliege CNS weitgehend in der Vergangenheit verwendet worden ist, um Liganden, Rezeptoren und intrazellulären Signalproteine axonalen Anleitung8,9gefordert zu identifizieren, hat die jüngsten Arbeiten die Wege in denen viele der untersucht. Diese Proteine Steuern Pathfinding Entscheidungen auch in späteren Phasen der Entwicklung. Insbesondere hat Untersuchung von Pilz Körper (MB) und Netzhaut Photorezeptor Neuron Entwicklung (Abbildung 1) Einblick in die Mechanismen dieser Kontrolle Wegfindung, Synapse Bildung, Axon beschneiden, und verschiedene andere Aspekte der neuronalen zur Verfügung gestellt Entwicklung10,11,12,13,14,15,16,17. Photorezeptor Neuronen verbinden die Fliege Netzhaut Regionen des erwachsenen Gehirns genannt der Lamina und Medulla und sind entscheidend für die Weiterleitung von visuellen Informationen an das Gehirn (rezensiert von18,19), während der Pilz Körper Neuronen sind zentral gelegen im Gehirn Fliege und sind erforderlich für lernen und Gedächtnis20,21. Photorezeptor Neuronen und die intrinsische Neuronen die Pilzkörper, Kenyon Zellen, genannt nutzen evolutionär konservierte diffusiblem und Kontakt-abhängige axonalen Anleitung Mechanismen um ihre postsynaptischen Ziele zu finden. Abgesehen davon, dass bei Erwachsenen fliegen, können Photorezeptor und MB Neuronen werden auch direkt in die Larven und Puppen mit Antikörpern oder Reporter Gene22,23,24,25visualisiert. Die Fähigkeit, leicht zu diesen beiden Gruppen von Neuronen zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten visualisieren hat ihre Verwendung als hervorragende Modelle für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung gefördert.
Neben dem Einsatz als Modell um zu verstehen, die Mechanismen der normalen Nervensystem Entwicklung, haben neuere Studien gezeigt, dass fliegen auch dazu als genaue Modelle für eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten dienen können, einschließlich Fragile X Syndrom (FXS)26 , Geistige Behinderung (ID)27,28,29,30,31, und andere32. Beispielsweise um die molekulare Funktion des ZC3H14 zu untersuchen, ein Gen, das vor kurzem verbunden mit menschlicher geistiger Behinderung haben wir fliegen Modellcharakter für die ID mit einer null Allel der Fliege ZC3H14 Ortholog, genannt Nab230. Fliegen fehlt Nab2 haben schweren Gedächtnisstörungen und poly(A) Tails erweitert, Rekapitulation was wird beobachtet bei menschlichen Patienten oder Patienten abgeleitet Zelle Linien33,34. Wichtig ist, anzeigen fliegen fehlt Nab2 auch schwere Gehirn Morphologie Mängel in ihren Erwachsenen Pilzkörper34, ähnlich wie was beobachtet wird, in denen das FXS-Syndrom gen, 135fliegen. So können fliegen dienen als ein wichtiger Modellorganismus, normale Gehirnentwicklung und Krankheiten, die es stören zu studieren.
Schließlich machen die Zugänglichkeit von Hochdurchsatz-Methoden, Verhalten, kombiniert mit der Vielzahl der verfügbaren genetischen Tools überwachen Drosophila Modellorganismus der Wahl für die Ermittlung der Hirnregionen, die komplexe Verhaltensweisen, wie z. B. Steuern lernen und Gedächtnis, Schlaf, Balz, Durst und andere36,37,38,39. Ein besonders nützliches Werkzeug, das in der Mitte eine Fliege Genetiker "Toolbox" ist ist das GAL4/UAS-System (Abbildung 2). Dieses System40,41 verwendet Gewebe Konkretisierung der Gal4 transcriptional Aktivator, um den Ausdruck der Gene oder transgene flussabwärts von einer vorgelagerten Aktivierung Sequenz (UAS) zu erhöhen. Änderungen dieses Systems konnten Forscher, z. B. genau steuern, die Erregbarkeit der spezifische Neuronen42,43, Overexpress oder Knock-down spezifischen Genen Interesse44, 45, Echtzeit-Kalzium Dynamik in Vivo46zu analysieren und express Reporter Gene neuronale Linien41markieren. Die Kombination aus der GAL4/UAS-System mit mitotische Rekombination, die auch für die Erstellung der Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM) System12,47erlaubt. MARCM ist beträchtlich bei der Rückverfolgung der einzelnen Nervenzelle benutzt worden, um zellulären Signalisierung für axonalen Führung12,47benötigten Komponenten zu identifizieren. Obwohl diese und andere Techniken etliche wertvolle Erkenntnisse über die zellulären Mechanismen erforderlich für die Funktion des Nervensystems zur Verfügung gestellt haben, erfordern die meisten, dass Drosophila Gehirn zuerst zerlegt werden; schonende Entfernung des Gehirns ist erforderlich, um korrekte Gehirn Morphologie und Verbindung Muster zwischen Gehirnregionen zu behalten. Das folgende Protokoll verwendet Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen alsBeispiel neuronalen Populationen als es führt Sie durch die Zerlegung und immunofluorescent Färbung der Erwachsenen Drosophila Gehirne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Nervensystem-Entwicklung beinhaltet eine sequenzielle Serie von Ereignissen, die durch mehrere Signalwege und Regulationsnetzwerke koordiniert werden. Viele von den Proteinen, die in diesen Bahnen sind evolutionär konserviert zwischen Säugetieren und anderen Eukaryoten, wie der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, was darauf hindeutet, dass ähnliche organisierende Grundregeln bei der Entwicklung dieser vorhanden Organismen. Wichtig ist, wurde Drosophila ausgiebig zur zelluläre und molekulare Mechanismen, die Regulierung der Prozesse, die erforderlich sind, bei Säugetieren einschließlich Neurogenese, Differenzierung, axonalen Beratung und Synaptogenese zu identifizieren. Fliegen haben auch erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl von menschlichen Neurodevelopmental Krankheiten zu modellieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schrittweise Mikrodissektion, Fixierung und immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen im erwachsenen Gehirn Drosophila . Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei Beispiel neuronalen Populationen, Pilz Körper Neuronen und retinalen Photorezeptoren und beinhaltet optionale Schritte zu einzelnen Pilz Körper Neuronen mit Mosaik-Analyse mit einer tragen Zelle Marker (MARCM) Technik zu verfolgen. Beispieldaten aus Wildtyp und Mutanten Gehirne sind mit einer kurzen Beschreibung der Bewertungskriterien für axonalen Anleitung Mängel gezeigt. Während dieses Protokoll zwei etablierte Antikörper zeigt für die Untersuchung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen, andere Hirnregionen Drosophila und die Lokalisierung der Proteine in anderen Hirnregionen können auch mit Hilfe dieses Protokolls untersucht.

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.2K Aufrufe.  The College of Wooster. Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Serie: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

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Untersuchung von Blut Zellpopulationen des

Aufzucht der Fruit Fly

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege