The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit britischen Innenministeriums Verordnungen und werden von der Cambridge ethischen Prüfungsausschuss genehmigt. 1. Probenentnahme <ol><li> Up zeitlich Paarung mit 8-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Mäuse mit erwachsenen Männern (bis 2 Weibchen pro Männchen) am Nachmittag gesetzt. Prüfen Sie auf das Vorhandensein von vaginalen Stecker als Zeichen der Kopulation früh am Morgen an den folgenden Tagen. Die Anwesenheit eines Steckers am Morgen Marken gd0.5. </li><li> Auf gd9.5, einschläfern das Tier durch Genickbruch und öffnen Sie die Bauchhöhle. Beachten Sie, dass die Euthanasie von CO 2 kann Vasodilatation verursachen. </li><li> Zahnseide, um sanft zu ligieren uterinen Arterien (1, gestrichelte Pfeile). Binden die Zahnseide um die Arterien an der Spitze jedes Uterushorn, proximal zu den Eierstöcken, sowie im Bereich der Zervix. Anmerkung: Bruch nicht die Gefäße, da dies zu stürzt Arterien führen. </li> &lt;li&gt; Präparieren des Uterus schnell mit Dissektion Schere, Herausschneiden des gesamten Uterus distal zu den drei Ligationsstellen an der Spitze des Uterushorns und des Gebärmutterhalses. </li><li> Platzieren des Uterus auf einem vorbereiteten Polystyrol Stück, so dass beide Hörner sind entlang der gleichen Längsachse in entgegengesetzten Richtungen aus dem Gebärmutterhals fluchten. Vorsichtig dehnen, und an Ort und Stelle mit 2-3 25 G Nadeln stecken. </li><li> Tauchen Sie das Polystyrol in eine vorbereitete 50 ml konischen Röhrchen. Aufstockung auf 50 ml mit 10% Formalin. Fix für 5-6 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die Formalin-Lösung und ersetzen mit 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min. </li><li> Auszuschneiden die beiden Uterushörner proximal an der Ligationsstelle an jedem Ende und proximal an der Zervix in der Mitte, schneiden Sie überschüssiges Fett um die Implantationsstellen und waschen zweimal in PBS für 5 Minuten, um Spuren von Formalin zu entfernen. </li><li> Speichern der Proben in 70% Ethanol bei 4 ° C (bis zu zwei Wochen), bis die Verarbeitung. ACHTUNG: Ethanol ist leicht entflammbar. </li><li> Verwenden eines automatisierten Verarbeitungssystems unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Parametern. Einbetten die Hörner einzeln in Paraffin, so daß sie in der Ebene senkrecht zu der langen Achse des Uterus geschnitten werden. Dies stellt sicher, dass die maximale Fläche jedes Implantationsstelle wird zur Analyse in der Mitte des Blocks (2A) ausgesetzt ist. OPTIONAL: Dies ist eine bequeme Zeitpunkt für die Randomisierung der Blöcke, falls gewünscht. </li><li> Mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten Serienschnitte von 7 um Dicke aus den Blöcken. Fleck ein Abschnitt an jedem 49 &amp; mgr; m-Intervall mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E, siehe Abschnitt 2.1). Bewahren Sie die übrigen Abschnitte bei Raumtemperatur für SMA Färbung und andere Downstream-Anwendungen. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Lösung </td><td style="width:43px;"> Zeit<html></td><td style="width:97px;"> Temperatur </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Einstellungen für automatisierte Gewebeverarbeitung Übersicht von der Einstellung für die Verarbeitung von Uterusgewebe verwendet 2. Stereological Bewertung <ol><li> H &amp; E-Färbung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen Objektträger in einer Objektträgerhalter in einer 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. VORSICHT: Xylol ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Diese Arbeit muss in einem Abzug durchgeführt werden, unter Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentielles Tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und gereinigtes Wasser für jeweils 5 Minuten. </li><li> Tauchen Dias in 50% Gill No 3 Hämatoxylin-Lösung, verdünnt mit gereinigtem Wasser, 5 min. ACHTUNG: Hämatoxylin ist gesundheitsschädlich beim Verschlucken und Kontakt mit Augen. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Waschen Sie Folien in einer Färbung Wanne unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten. </li><li> Einzutauchen gleitet in 1% Säure / Alkohol-Lösung (1% 10 M Chlorwasserstoffsäure in 70% Ethanol) 10 Sekund waschen in einem Färbetrog unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Tauchen Sie Folien in Eosin-Lösung für 30 Sekunden und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser für 10 min. </li><li> Innerhalb eines Laborabzugs, sequentiell einzutauchen Folien in Bädern, die 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop. </li></ol></li><li> Stereo Bewertung der Behältergröße und Remodeling-Status <ol><li> Für jede Implantationsstelle, festzustellen, welche Bereiche in der Nähe des Mediapunkt sind. Die Chorioallantois Befestigung zwischen dem Fötus und sich entwickelnden Plazenta dient als ein guter Indikator für die Mediapunkt. </li><li> Wählen Sie 3 Abschnitte auf 49 &amp; mgr; m Abständen nahe dem Mediapunkt für die Analyse. Scannen ausgewählten Folien. Um zu vermeiden, incLuding Venen, die gezeigt haben, um mehr peripher in den Implantationsstellen 16 befinden, beschränken die Analyse auf dem zentralen 2/4 jedes Implantationsstelle (Abbildung 2A). </li><li> Um Lumengröße zu bewerten, um das Innere der Behälter zu ziehen und Aufzeichnung der Fläche dieser Form. Für die gesamte Gefäßgröße, ziehen um die Außenwand des Gefäßes, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und intra-Leukozyten. Anmerkung: Der Anteil des gesamten Gefäßgröße zum Lumen ist ein Proxy für den Umbau Status eines Behälters. Als die Gefäße der Spule durch die Ebene, die der Schnitt entlang schneiden kann es mehrere Querschnitte des gleichen Arterie in eine Folie sein. Vermeiden Sie die Messung der gleichen Arterie mehrmals. </li><li> Die Messungen werden von den 5 Schiffe in jedem Implantationsstelle mit den größten und rund Lumen. Jeweils eine Messung Implantationsort in dreifacher Ausfertigung (drei Abschnitte 49 um beabstandet voneinander). Der Durchschnitt dieser 15 Messungen represengen des mittleren Durchmessers der größten Gefäße. </li><li> Um Überrepräsentation von größeren Schiffen in einigen Proben zu vermeiden, messen Sie die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle. </li></ol></li></ol> 3. Qualitative Bewertung mittels Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinierung und Rehydrierung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen in eine hitzebeständige Folien Gleitzahnstange in einen 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentiell tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol und 70% und gereinigtes Wasser für jede 5 min. </li></ol></li><li> Antigen-Retrieval <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Natriumcitratpuffer in gereinigtem Wasser und auf pH 6 mit 10 M Chlorwasserstoffsäure. </li><li> Füllen Sie einen hitzebeständigen Behälter, der 600 ml mit 400 ml Natriumcitratpuffer und in einen heimischen Kochtopf, die ausreichend wat halten kanner auf die Hälfte des Behälters eintauchen. Lose befestigen Sie den Deckel des Druckkochtopf und Hitze zum Kochen bringen. </li><li> Den Objektträger-Rack in die Natriumcitratpuffer und fest fixieren den Deckel des Dampfkochtopf. Sobald unter Druck, zu ermöglichen, für 3 Minuten kochen. </li><li> Drucklos machen Schnellkochtopf, und entfernen Sie den Innenbehälter. Die Objektträger in der Natriumcitrat-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Wasch gleitet in einem Bad, das gereinigte Wasser für 5 min. </li><li> Umkreisen die Abschnitte unter Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in PBS für 5 min. </li></ol></li><li> Blockier Endogene Peroxidase und nicht-spezifische Bindung <ol><li> Inkubieren Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid in gereinigtem Wasser in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. ACHTUNG: Wasserstoffperoxid ist stark reizend auf Augen, Haut und beim Verschlucken. Tragen Sie geeignete PSA. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Wasserstoffperoxid-Lösung und waschen slides zweimal durch Eintauchen in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), jeweils 2 min. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Maus-Immunglobulin Blockierungsreagens aus der Maus zu Maus-Kit nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS für jeweils 2 Min. </li></ol></li><li> Immundetektion von Glattmuskelaktin <ol><li> Bereiten Antikörper-Verdünnungslösung (im Kit enthalten) und Inkubation mit Abschnitten für 5 min bei Raumtemperatur oder nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünnen Sie 1: 100 Maus-Anti-Human-Glattmuskelaktin (DAKO M0851) in Antikörperverdünnungslösung. Verdünnte Maus-IgG2a Isotyp-Kontrolle bei der Antikörperverdünnungslösung, um sicherzustellen, dass die endgültige Immunglobulinkonzentration entspricht in beiden Lösungen. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Antikörperverdünnungslösung und Deckelabschnitte entweder mit verdünnten Antikörpers oder Isotypkontrolle Lösungen. Inkubieren in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS2 Minuten jeweils. </li><li> Verdünnter biotinylierter Anti-Maus-Sekundär-Antikörper und Inkubation Schnitte für 10 Minuten bei Raumtemperatur oder entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wasch gleitet je einmal mit TBS und PBS für 2 min auf. </li><li> Vorbereitung 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Deckelabschnitte mit DAB-Lösung und Inkubation für bis zu 4 min, wodurch die Abschnitte zu überwachen, um überschüssige Farbentwicklung zu vermeiden. ACHTUNG: DAB ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Tauchen Dias in gereinigtem Wasser, sobald gewünschte Intensität der Färbung erreicht ist. </li><li> Mit 50% Gill No. 3 Hämatoxylin 20 Sek Gegenfärben und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser bis das Wasser klar. </li></ol></li><li> Dehydrierung und Montage <ol><li> Innerhalb einer Abzugshaube, nacheinander eintauchen Folien in Bädern, die 70% der ETHnol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop </li></ol></li></ol>

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	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das hier vorgestellte Protokoll ist so ausgelegt, ein reproduzierbares Verfahren, mit dem die Gefäßveränderungen, die für eine erfolgreiche Schwangerschaft erforderlich bewerten. Entscheidend für den Erfolg dieser Auswertung ist die Qualität der Gewebeschnitten. Sowohl die genaue Bestimmung der Schwangerschaftsalter der Implantationsstellen sowie zuverlässig Ligieren der Gebärmutterarterien sind entscheidende Schritte. Veränderungen in Parametern wie Zeitpunkt der Fixierung, Gewebeverarbeitung Protokoll usw. kann ebenfalls Einfluss auf das Ergebnis. Für eine unvoreingenommene stereoBewertung, ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle zu messen. Es wird empfohlen, 5 Schiffe pro Implantationsstelle und jeder Implantationsstelle in dreifacher Ausführung zu messen. Der Mittelwert dieser 15 Messungen repräsentiert die mittlere Größe der 5 größten Gefäße. Zusätzlich zu den Daten aus alymphoid Rag2 - / - IL2RG - / - hier gezeigten Mäuse, fanden wir dieses protOcol für eine Anzahl von Modellen von unzureichender mütterlichen Immunfunktion, einschließlich einer von NK-Zellen inhibierten 14. Defekte im arteriellen Umbau wurden auch in Modellen von beeinträchtigt Trophoblastinvasion 18 gezeigt und die hier beschriebenen Techniken können hilfreich sein, die Gefäßsystem in diesen Fällen zu beurteilen. Wir optimiert und validiert dieses Protokoll für die Untersuchung der Dezidua-vaskulären Remodelling in der Mitte der Schwangerschaft bei Mäusen, aber es ist auch denkbar, dieses Protokoll anzupassen in anderen Modellsystemen (zB Ratten) oder auch in andere Organe zu arbeiten. Während wir feststellen, dass die NK-abhängige Remodeling kann kräftig an gd9.5 beurteilt werden kann, kann es auch für andere Zeitpunkte wie gd12.5, wenn die mütterliche Vaskulatur ist komplett neu geändert werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die endovaskuläre Trophoblastinvasion tiefere 16 und dieser Zeitpunkt besser geeignet für die Untersuchung der Rolle von Trophoblasten für vaskuläre Veränderungen. Wenn zusätzliche quantitative Ablesungen gewünscht werden,Ermittler können auch die Anzahl der Abschnitte für SMA befleckt zu erhöhen und zu bewerten den Anteil der teilweise umgebaut Gefäße innerhalb jeder Implantationsstelle. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der beschreibende Charakter histologische Untersuchungen. Funktionelle Assays sind jedoch erst langsam verfügbar (zB Doppler-Ultraschall-19). Diese Techniken erfordern technisches Know-how und viel höhere Ausgaben für den Erwerb und die Aufrechterhaltung Ausrüstung, haben aber den Vorteil, dass eine Längs in vivo Anzeige für den Effekt der Änderungen, die histologisch beobachtet werden können. Ein möglicher Nachteil aller stereo Untersuchungen ist die Subjektivität der Ermittler. Zu diesem Zweck wird mit Hilfe von zwei unabhängigen Prüfern, die unabhängig voneinander alle Proben zu analysieren kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Während das Protokoll hier skizzierten gibt Einblick in, wie viel Blut das fetomaternalen Schnittstelle zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, es mit dem kompl kombinierenementary Ansatz zur Bewertung der Gesamtblutmenge zu einem bestimmten Zeitpunkt in dem Gefäßsystem durch plastische wirft 16. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass sie zwei unabhängigen Ansätzen. Gefäßwechsel wird zunächst quantitativ durch Stereologie untersucht und das Ergebnis wird dann qualitativ mittels Immunhistochemie validiert. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse können weiter verstärkt werden durch Randomisierung der Proben. Die für dieses Protokoll hergestellten Proben können leicht verwendet werden, um auch untersuchen, andere Parameter der Schwangerschaft wie Dezidualisierung, Entwicklung des mesometrial lymphatischen Aggregat der Schwangerschaft (mlap) oder Immundetektion von Zellen von Interesse, konsequent zu bewerten, eine Schwangerschaft Phänotyp bei midgestation werden. Arterielle Remodeling ist ein entscheidender Schritt für die unkomplizierte Schwangerschaften bei Frauen und Misserfolg dieser Veränderungen untermauert die großen geburtshilflichen Syndromen (GOS), nämlich eine Präeklampsie, fetale Wachstumsrestriktion undTotgeburt. Wir stellen Ihnen hier Techniken, um sorgfältig zu prüfen, eine Schwangerschaft Phänotyp in Maus-Modellen, die einige Merkmale der Pathophysiologie der GOS imitieren.

Der Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten bei eutherian Schwangerschaft wird durch die Plazenta vermittelt. In der weiblichen Genitaltrakt, die Gebärmutterarterien sind die Hauptleitungen von Blut in die Gebärmutter. Nach der Implantation dieser Zweig in Spezialschiffe genannt Spiralarterien, die durch die Dezidua basalis Richtung fetoplazentaren Einheitsspule. Durchmesser und Elastizität dieser Spiralarterien, die durch Leukozyten umgeben sind, insbesondere Gebärmutter natürliche Killerzellen (unk) -Zellen, diktieren Volumen und die Geschwindigkeit des Blutes zur Verfügung Plazenta 1,2. Korrekte hämodynamischen Veränderungen infolge der Umgestaltung der Spiralarterien sind entscheidend für Erfolg der Schwangerschaft. Während die zugrunde liegenden Mechanismen unterscheiden sich im Detail zwischen humanen und murinen Schwangerschaft, ist das endgültige Ergebnis der Umbauprozess in beiden Spezies erweitert, hoher Leitfähigkeit Gefäßsystem, das seinen glatten Muskulatur verliert. Bei Mäusen UNK-Zellen abgeleiteten Interferon (IFN-) γ ist notwendig, um diese Änderungen bei etwa der Mitte der Schwangerschaft 3-5 induzieren. Mäuse, die entweder NK-Zellen oder Komponenten der IFN-γ-Signalweg fehlt nicht, um diese Änderungen zu unterziehen, und dies wird mit reduzierter fetale Wachstum 6,7 zugeordnet, was die Wichtigkeit einer ausreichenden Blutversorgung des fetoplazentaren Einheit. Während der frühen Schwangerschaft, die interstitielle und endovaskuläre Invasion extravillösen Trophoblasten und ihre Wechselwirkung mit unk Zellen sind wichtig für die Induktion von Gefäßveränderungen und die Förderung der fetale Wachstum 8-10. unk Zellen können menschliche Trophoblasten-Invasion durch Chemokine 11 und Cytokine, wie Granulozyten-Makrophagen dirigieren - Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) 12. Shallow Trophoblastinvasion mit reduziertem arteriellen Umbau und Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie 9 verbunden. Dieses Protokoll wird von der Pionierarbeit von Anne Croy, der die wichtigsten beschrieben auf der BasisRolle des Immunsystems und insbesondere NK-abgeleitete IFN-γ für eine erfolgreiche vaskuläre Remodelling durch Immunhistochemie und elegant Transferexperimente 5,13. Hier beschreiben wir eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um den Umbau Status der Spiralarterien zu bewerten. Obwohl unser Labor routinemäßig beurteilt dies auf der Mitte der Schwangerschaft (Schwangerschafts Tag (gd) 9,5) 14, zwischen gd8.5 und 12,5 15 nimmt der Umbauprozess statt. Das Aufkommen von automatisierten Diascanner hat stark die Beurteilung der Gefäßlumen und Bereiche von Abschnitten erleichtert, und wir fanden, dass dies ein reproduzierbarer Ansatz als Messgefäßdurchmesser sein. Die Zugabe von immunhistochemischen Nachweis von SMA ermöglicht eine einfache Überprüfung der aus dem stereo Beurteilung erhaltenen Ergebnisse. Wie bei allen stereo Techniken, ist es empfehlenswert, die Beurteilung als blind Experiment von mindestens zwei Prüfern durchzuführen. Zu diesem Zweck kann eine Randomisierung Schritt eingeführt wird, wenn seriell schneidenting die Proben so, dass die Ermittler die Beurteilung der Objektträger nicht wissen, aus dem Versuchsgruppe die Proben kommen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein zuverlässiges Werkzeug, um sorgfältig zu prüfen, die Umgestaltung der Spiralarterien bei Mäusen mit definierten mütterlichen und väterlichen Genotypen, im Zusammenhang mit der Mausmodelle für Schwangerschaftskomplikationen zu schaffen. Die Ergebnisse unterstreichen die Abhängigkeit von Unk Zellen dieser Prozess, der für die normale fetale Wachstum ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen fehlt alle reifen Lymphozyten, NK-Zellen, einschließlich 17, und deren Gebärmutterarterien nicht den Gefäßveränderungen in kongenen Wildtyp C57BL / 6 (WT) Mäusen etwa Mitte der Trächtigkeit 5,14 gesehen, zu unterziehen. Als Ergebnis dieser verringerten Umbau Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse zeigen deutlich kleiner Lumenoberflächenbereiche, indikativ für allgemeine kleinere Schiffe, die auf H &amp; E-gefärbten Schnitten sichtbar gemacht werden kann und quantifiziert stereologically (Abbildung 2). Ferner ist die relative Wandstärke (Gefäß-Lumen-Verhältnis) in der Spiralarterien in diesen Mäusen höher, was auf verringerte Blutzufuhr und eine höhere Strömungsgeschwindigkeit des Blutes. Diese quantitative Bewertung wurde mit immunhistochemischen Nachweis von SMA bestätigt. Es ist charakteristisch für die WT-Mäusen, die meisten der SMA im Gefäß Medien verlierender Spiralarterien von der Mitte der Schwangerschaft. Wenn dieser NK-Zell-gesteuerten Prozess nicht stattfindet, bleibt SMA in den Medien der Gefäße und kann leicht immunhistochemisch wie Ringe um die Blutgefäße (Abbildung 3) festgestellt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Abbildung 1: Maus-Uterus bei gd9.5, schematische Übersicht Zeichnung, die die relativen Positionen des Uterushörner, Zervix (blau) und Hauptgebärmutterarterien (rot).. Angegeben ist jeweils die lange Achse des Uterushorns (Pfeile) und die Ligationspunkte (gestrichelte Pfeile). Die Abschnitte für die Immunhistochemie entlang der Sichtebene geschnitten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Abb. 2: stereo Beurteilung der arteriellen Umbau an der Mitte der Schwangerschaft (A) Beispiel assessment der luminalen und Gesamtgefäß Bereiche auf H &amp; E-gefärbten Schnitten von WT Frauen im mittleren 2/4 der Dezidua basalis (durch die vertikale schwarze abgegrenzt gestrichelte Linien) bei gd9.5. In den Gefäßen bei höherer Vergrößerung, gestrichelte rote Linie abgrenzt Gesamtgefäßfläche, gelb gestrichelte Linie abgrenzt Lumenfläche. Bar = 500 &amp; mgr; m (links), 50 &amp; mgr; m (rechts). Die lange Achse des Uterus ist eine horizontale Linie in dieser Ausrichtung. (B) Quantifizierung der luminalen Bereiche (links) und das Verhältnis von Lumenfläche insgesamt Gefäßfläche (rechts) von WT (C57BL / 6) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse (auf C57BL / 6 Hintergrund). Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 15 Messungen (5 Messungen pro Abschnitt 3 Abschnitte pro Implantationsstelle). Balken stellen von n = 11-13 Implantationsstellen aus 4 Schwangerschaften pro Gruppe bedeuten; p-Wert aus einem zweiseitigen, ungepaarten Mann-Whitney-Test. WT: Wildtyp. <img alt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Abb. 3: Immunhistochemische Detektion von Glattmuskelaktin in der Dezidua basalis Vertreter SMA Färbung auf WT (oben) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen (auf C57BL / 6 Hintergrund, unten) an gd9.5. Bar = 100 &amp; mgr; m. WT: Wildtyp.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K Aufrufe.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Serie: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden<em&gt; In Vitro</em&gt; Oozytenreifung in Zebrabärbling

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...