Name: assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
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The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit britischen Innenministeriums Verordnungen und werden von der Cambridge ethischen Prüfungsausschuss genehmigt. 1. Probenentnahme <ol><li> Up zeitlich Paarung mit 8-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Mäuse mit erwachsenen Männern (bis 2 Weibchen pro Männchen) am Nachmittag gesetzt. Prüfen Sie auf das Vorhandensein von vaginalen Stecker als Zeichen der Kopulation früh am Morgen an den folgenden Tagen. Die Anwesenheit eines Steckers am Morgen Marken gd0.5. </li><li> Auf gd9.5, einschläfern das Tier durch Genickbruch und öffnen Sie die Bauchhöhle. Beachten Sie, dass die Euthanasie von CO 2 kann Vasodilatation verursachen. </li><li> Zahnseide, um sanft zu ligieren uterinen Arterien (1, gestrichelte Pfeile). Binden die Zahnseide um die Arterien an der Spitze jedes Uterushorn, proximal zu den Eierstöcken, sowie im Bereich der Zervix. Anmerkung: Bruch nicht die Gefäße, da dies zu stürzt Arterien führen. </li> &lt;li&gt; Präparieren des Uterus schnell mit Dissektion Schere, Herausschneiden des gesamten Uterus distal zu den drei Ligationsstellen an der Spitze des Uterushorns und des Gebärmutterhalses. </li><li> Platzieren des Uterus auf einem vorbereiteten Polystyrol Stück, so dass beide Hörner sind entlang der gleichen Längsachse in entgegengesetzten Richtungen aus dem Gebärmutterhals fluchten. Vorsichtig dehnen, und an Ort und Stelle mit 2-3 25 G Nadeln stecken. </li><li> Tauchen Sie das Polystyrol in eine vorbereitete 50 ml konischen Röhrchen. Aufstockung auf 50 ml mit 10% Formalin. Fix für 5-6 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die Formalin-Lösung und ersetzen mit 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min. </li><li> Auszuschneiden die beiden Uterushörner proximal an der Ligationsstelle an jedem Ende und proximal an der Zervix in der Mitte, schneiden Sie überschüssiges Fett um die Implantationsstellen und waschen zweimal in PBS für 5 Minuten, um Spuren von Formalin zu entfernen. </li><li> Speichern der Proben in 70% Ethanol bei 4 ° C (bis zu zwei Wochen), bis die Verarbeitung. ACHTUNG: Ethanol ist leicht entflammbar. </li><li> Verwenden eines automatisierten Verarbeitungssystems unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Parametern. Einbetten die Hörner einzeln in Paraffin, so daß sie in der Ebene senkrecht zu der langen Achse des Uterus geschnitten werden. Dies stellt sicher, dass die maximale Fläche jedes Implantationsstelle wird zur Analyse in der Mitte des Blocks (2A) ausgesetzt ist. OPTIONAL: Dies ist eine bequeme Zeitpunkt für die Randomisierung der Blöcke, falls gewünscht. </li><li> Mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten Serienschnitte von 7 um Dicke aus den Blöcken. Fleck ein Abschnitt an jedem 49 &amp; mgr; m-Intervall mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E, siehe Abschnitt 2.1). Bewahren Sie die übrigen Abschnitte bei Raumtemperatur für SMA Färbung und andere Downstream-Anwendungen. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Lösung </td><td style="width:43px;"> Zeit<html></td><td style="width:97px;"> Temperatur </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Einstellungen für automatisierte Gewebeverarbeitung Übersicht von der Einstellung für die Verarbeitung von Uterusgewebe verwendet 2. Stereological Bewertung <ol><li> H &amp; E-Färbung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen Objektträger in einer Objektträgerhalter in einer 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. VORSICHT: Xylol ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Diese Arbeit muss in einem Abzug durchgeführt werden, unter Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentielles Tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und gereinigtes Wasser für jeweils 5 Minuten. </li><li> Tauchen Dias in 50% Gill No 3 Hämatoxylin-Lösung, verdünnt mit gereinigtem Wasser, 5 min. ACHTUNG: Hämatoxylin ist gesundheitsschädlich beim Verschlucken und Kontakt mit Augen. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Waschen Sie Folien in einer Färbung Wanne unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten. </li><li> Einzutauchen gleitet in 1% Säure / Alkohol-Lösung (1% 10 M Chlorwasserstoffsäure in 70% Ethanol) 10 Sekund waschen in einem Färbetrog unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Tauchen Sie Folien in Eosin-Lösung für 30 Sekunden und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser für 10 min. </li><li> Innerhalb eines Laborabzugs, sequentiell einzutauchen Folien in Bädern, die 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop. </li></ol></li><li> Stereo Bewertung der Behältergröße und Remodeling-Status <ol><li> Für jede Implantationsstelle, festzustellen, welche Bereiche in der Nähe des Mediapunkt sind. Die Chorioallantois Befestigung zwischen dem Fötus und sich entwickelnden Plazenta dient als ein guter Indikator für die Mediapunkt. </li><li> Wählen Sie 3 Abschnitte auf 49 &amp; mgr; m Abständen nahe dem Mediapunkt für die Analyse. Scannen ausgewählten Folien. Um zu vermeiden, incLuding Venen, die gezeigt haben, um mehr peripher in den Implantationsstellen 16 befinden, beschränken die Analyse auf dem zentralen 2/4 jedes Implantationsstelle (Abbildung 2A). </li><li> Um Lumengröße zu bewerten, um das Innere der Behälter zu ziehen und Aufzeichnung der Fläche dieser Form. Für die gesamte Gefäßgröße, ziehen um die Außenwand des Gefäßes, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und intra-Leukozyten. Anmerkung: Der Anteil des gesamten Gefäßgröße zum Lumen ist ein Proxy für den Umbau Status eines Behälters. Als die Gefäße der Spule durch die Ebene, die der Schnitt entlang schneiden kann es mehrere Querschnitte des gleichen Arterie in eine Folie sein. Vermeiden Sie die Messung der gleichen Arterie mehrmals. </li><li> Die Messungen werden von den 5 Schiffe in jedem Implantationsstelle mit den größten und rund Lumen. Jeweils eine Messung Implantationsort in dreifacher Ausfertigung (drei Abschnitte 49 um beabstandet voneinander). Der Durchschnitt dieser 15 Messungen represengen des mittleren Durchmessers der größten Gefäße. </li><li> Um Überrepräsentation von größeren Schiffen in einigen Proben zu vermeiden, messen Sie die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle. </li></ol></li></ol> 3. Qualitative Bewertung mittels Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinierung und Rehydrierung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen in eine hitzebeständige Folien Gleitzahnstange in einen 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentiell tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol und 70% und gereinigtes Wasser für jede 5 min. </li></ol></li><li> Antigen-Retrieval <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Natriumcitratpuffer in gereinigtem Wasser und auf pH 6 mit 10 M Chlorwasserstoffsäure. </li><li> Füllen Sie einen hitzebeständigen Behälter, der 600 ml mit 400 ml Natriumcitratpuffer und in einen heimischen Kochtopf, die ausreichend wat halten kanner auf die Hälfte des Behälters eintauchen. Lose befestigen Sie den Deckel des Druckkochtopf und Hitze zum Kochen bringen. </li><li> Den Objektträger-Rack in die Natriumcitratpuffer und fest fixieren den Deckel des Dampfkochtopf. Sobald unter Druck, zu ermöglichen, für 3 Minuten kochen. </li><li> Drucklos machen Schnellkochtopf, und entfernen Sie den Innenbehälter. Die Objektträger in der Natriumcitrat-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Wasch gleitet in einem Bad, das gereinigte Wasser für 5 min. </li><li> Umkreisen die Abschnitte unter Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in PBS für 5 min. </li></ol></li><li> Blockier Endogene Peroxidase und nicht-spezifische Bindung <ol><li> Inkubieren Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid in gereinigtem Wasser in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. ACHTUNG: Wasserstoffperoxid ist stark reizend auf Augen, Haut und beim Verschlucken. Tragen Sie geeignete PSA. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Wasserstoffperoxid-Lösung und waschen slides zweimal durch Eintauchen in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), jeweils 2 min. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Maus-Immunglobulin Blockierungsreagens aus der Maus zu Maus-Kit nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS für jeweils 2 Min. </li></ol></li><li> Immundetektion von Glattmuskelaktin <ol><li> Bereiten Antikörper-Verdünnungslösung (im Kit enthalten) und Inkubation mit Abschnitten für 5 min bei Raumtemperatur oder nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünnen Sie 1: 100 Maus-Anti-Human-Glattmuskelaktin (DAKO M0851) in Antikörperverdünnungslösung. Verdünnte Maus-IgG2a Isotyp-Kontrolle bei der Antikörperverdünnungslösung, um sicherzustellen, dass die endgültige Immunglobulinkonzentration entspricht in beiden Lösungen. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Antikörperverdünnungslösung und Deckelabschnitte entweder mit verdünnten Antikörpers oder Isotypkontrolle Lösungen. Inkubieren in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS2 Minuten jeweils. </li><li> Verdünnter biotinylierter Anti-Maus-Sekundär-Antikörper und Inkubation Schnitte für 10 Minuten bei Raumtemperatur oder entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wasch gleitet je einmal mit TBS und PBS für 2 min auf. </li><li> Vorbereitung 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Deckelabschnitte mit DAB-Lösung und Inkubation für bis zu 4 min, wodurch die Abschnitte zu überwachen, um überschüssige Farbentwicklung zu vermeiden. ACHTUNG: DAB ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Tauchen Dias in gereinigtem Wasser, sobald gewünschte Intensität der Färbung erreicht ist. </li><li> Mit 50% Gill No. 3 Hämatoxylin 20 Sek Gegenfärben und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser bis das Wasser klar. </li></ol></li><li> Dehydrierung und Montage <ol><li> Innerhalb einer Abzugshaube, nacheinander eintauchen Folien in Bädern, die 70% der ETHnol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das hier vorgestellte Protokoll ist so ausgelegt, ein reproduzierbares Verfahren, mit dem die Gefäßveränderungen, die für eine erfolgreiche Schwangerschaft erforderlich bewerten. Entscheidend für den Erfolg dieser Auswertung ist die Qualität der Gewebeschnitten. Sowohl die genaue Bestimmung der Schwangerschaftsalter der Implantationsstellen sowie zuverlässig Ligieren der Gebärmutterarterien sind entscheidende Schritte. Veränderungen in Parametern wie Zeitpunkt der Fixierung, Gewebeverarbeitung Protokoll usw. kann ebenfalls Einfluss auf das Ergebnis. Für eine unvoreingenommene stereoBewertung, ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle zu messen. Es wird empfohlen, 5 Schiffe pro Implantationsstelle und jeder Implantationsstelle in dreifacher Ausführung zu messen. Der Mittelwert dieser 15 Messungen repräsentiert die mittlere Größe der 5 größten Gefäße. Zusätzlich zu den Daten aus alymphoid Rag2 - / - IL2RG - / - hier gezeigten Mäuse, fanden wir dieses protOcol für eine Anzahl von Modellen von unzureichender mütterlichen Immunfunktion, einschließlich einer von NK-Zellen inhibierten 14. Defekte im arteriellen Umbau wurden auch in Modellen von beeinträchtigt Trophoblastinvasion 18 gezeigt und die hier beschriebenen Techniken können hilfreich sein, die Gefäßsystem in diesen Fällen zu beurteilen. Wir optimiert und validiert dieses Protokoll für die Untersuchung der Dezidua-vaskulären Remodelling in der Mitte der Schwangerschaft bei Mäusen, aber es ist auch denkbar, dieses Protokoll anzupassen in anderen Modellsystemen (zB Ratten) oder auch in andere Organe zu arbeiten. Während wir feststellen, dass die NK-abhängige Remodeling kann kräftig an gd9.5 beurteilt werden kann, kann es auch für andere Zeitpunkte wie gd12.5, wenn die mütterliche Vaskulatur ist komplett neu geändert werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die endovaskuläre Trophoblastinvasion tiefere 16 und dieser Zeitpunkt besser geeignet für die Untersuchung der Rolle von Trophoblasten für vaskuläre Veränderungen. Wenn zusätzliche quantitative Ablesungen gewünscht werden,Ermittler können auch die Anzahl der Abschnitte für SMA befleckt zu erhöhen und zu bewerten den Anteil der teilweise umgebaut Gefäße innerhalb jeder Implantationsstelle. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der beschreibende Charakter histologische Untersuchungen. Funktionelle Assays sind jedoch erst langsam verfügbar (zB Doppler-Ultraschall-19). Diese Techniken erfordern technisches Know-how und viel höhere Ausgaben für den Erwerb und die Aufrechterhaltung Ausrüstung, haben aber den Vorteil, dass eine Längs in vivo Anzeige für den Effekt der Änderungen, die histologisch beobachtet werden können. Ein möglicher Nachteil aller stereo Untersuchungen ist die Subjektivität der Ermittler. Zu diesem Zweck wird mit Hilfe von zwei unabhängigen Prüfern, die unabhängig voneinander alle Proben zu analysieren kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Während das Protokoll hier skizzierten gibt Einblick in, wie viel Blut das fetomaternalen Schnittstelle zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, es mit dem kompl kombinierenementary Ansatz zur Bewertung der Gesamtblutmenge zu einem bestimmten Zeitpunkt in dem Gefäßsystem durch plastische wirft 16. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass sie zwei unabhängigen Ansätzen. Gefäßwechsel wird zunächst quantitativ durch Stereologie untersucht und das Ergebnis wird dann qualitativ mittels Immunhistochemie validiert. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse können weiter verstärkt werden durch Randomisierung der Proben. Die für dieses Protokoll hergestellten Proben können leicht verwendet werden, um auch untersuchen, andere Parameter der Schwangerschaft wie Dezidualisierung, Entwicklung des mesometrial lymphatischen Aggregat der Schwangerschaft (mlap) oder Immundetektion von Zellen von Interesse, konsequent zu bewerten, eine Schwangerschaft Phänotyp bei midgestation werden. Arterielle Remodeling ist ein entscheidender Schritt für die unkomplizierte Schwangerschaften bei Frauen und Misserfolg dieser Veränderungen untermauert die großen geburtshilflichen Syndromen (GOS), nämlich eine Präeklampsie, fetale Wachstumsrestriktion undTotgeburt. Wir stellen Ihnen hier Techniken, um sorgfältig zu prüfen, eine Schwangerschaft Phänotyp in Maus-Modellen, die einige Merkmale der Pathophysiologie der GOS imitieren.

Der Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten bei eutherian Schwangerschaft wird durch die Plazenta vermittelt. In der weiblichen Genitaltrakt, die Gebärmutterarterien sind die Hauptleitungen von Blut in die Gebärmutter. Nach der Implantation dieser Zweig in Spezialschiffe genannt Spiralarterien, die durch die Dezidua basalis Richtung fetoplazentaren Einheitsspule. Durchmesser und Elastizität dieser Spiralarterien, die durch Leukozyten umgeben sind, insbesondere Gebärmutter natürliche Killerzellen (unk) -Zellen, diktieren Volumen und die Geschwindigkeit des Blutes zur Verfügung Plazenta 1,2. Korrekte hämodynamischen Veränderungen infolge der Umgestaltung der Spiralarterien sind entscheidend für Erfolg der Schwangerschaft. Während die zugrunde liegenden Mechanismen unterscheiden sich im Detail zwischen humanen und murinen Schwangerschaft, ist das endgültige Ergebnis der Umbauprozess in beiden Spezies erweitert, hoher Leitfähigkeit Gefäßsystem, das seinen glatten Muskulatur verliert. Bei Mäusen UNK-Zellen abgeleiteten Interferon (IFN-) γ ist notwendig, um diese Änderungen bei etwa der Mitte der Schwangerschaft 3-5 induzieren. Mäuse, die entweder NK-Zellen oder Komponenten der IFN-γ-Signalweg fehlt nicht, um diese Änderungen zu unterziehen, und dies wird mit reduzierter fetale Wachstum 6,7 zugeordnet, was die Wichtigkeit einer ausreichenden Blutversorgung des fetoplazentaren Einheit. Während der frühen Schwangerschaft, die interstitielle und endovaskuläre Invasion extravillösen Trophoblasten und ihre Wechselwirkung mit unk Zellen sind wichtig für die Induktion von Gefäßveränderungen und die Förderung der fetale Wachstum 8-10. unk Zellen können menschliche Trophoblasten-Invasion durch Chemokine 11 und Cytokine, wie Granulozyten-Makrophagen dirigieren - Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) 12. Shallow Trophoblastinvasion mit reduziertem arteriellen Umbau und Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie 9 verbunden. Dieses Protokoll wird von der Pionierarbeit von Anne Croy, der die wichtigsten beschrieben auf der BasisRolle des Immunsystems und insbesondere NK-abgeleitete IFN-γ für eine erfolgreiche vaskuläre Remodelling durch Immunhistochemie und elegant Transferexperimente 5,13. Hier beschreiben wir eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um den Umbau Status der Spiralarterien zu bewerten. Obwohl unser Labor routinemäßig beurteilt dies auf der Mitte der Schwangerschaft (Schwangerschafts Tag (gd) 9,5) 14, zwischen gd8.5 und 12,5 15 nimmt der Umbauprozess statt. Das Aufkommen von automatisierten Diascanner hat stark die Beurteilung der Gefäßlumen und Bereiche von Abschnitten erleichtert, und wir fanden, dass dies ein reproduzierbarer Ansatz als Messgefäßdurchmesser sein. Die Zugabe von immunhistochemischen Nachweis von SMA ermöglicht eine einfache Überprüfung der aus dem stereo Beurteilung erhaltenen Ergebnisse. Wie bei allen stereo Techniken, ist es empfehlenswert, die Beurteilung als blind Experiment von mindestens zwei Prüfern durchzuführen. Zu diesem Zweck kann eine Randomisierung Schritt eingeführt wird, wenn seriell schneidenting die Proben so, dass die Ermittler die Beurteilung der Objektträger nicht wissen, aus dem Versuchsgruppe die Proben kommen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein zuverlässiges Werkzeug, um sorgfältig zu prüfen, die Umgestaltung der Spiralarterien bei Mäusen mit definierten mütterlichen und väterlichen Genotypen, im Zusammenhang mit der Mausmodelle für Schwangerschaftskomplikationen zu schaffen. Die Ergebnisse unterstreichen die Abhängigkeit von Unk Zellen dieser Prozess, der für die normale fetale Wachstum ist.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental floss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td></td><td></td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>Straight dissection scissors</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene-based mounting media</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td></tr><tr><td>Pressure cooker</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on mouse kit</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Significantly reduces background</td></tr><tr><td>Mouse anti-human smooth muscle actin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Cross-reacts with mouse</td></tr><tr><td>IgG2a isotype control</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine solution</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen fehlt alle reifen Lymphozyten, NK-Zellen, einschließlich 17, und deren Gebärmutterarterien nicht den Gefäßveränderungen in kongenen Wildtyp C57BL / 6 (WT) Mäusen etwa Mitte der Trächtigkeit 5,14 gesehen, zu unterziehen. Als Ergebnis dieser verringerten Umbau Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse zeigen deutlich kleiner Lumenoberflächenbereiche, indikativ für allgemeine kleinere Schiffe, die auf H &amp; E-gefärbten Schnitten sichtbar gemacht werden kann und quantifiziert stereologically (Abbildung 2). Ferner ist die relative Wandstärke (Gefäß-Lumen-Verhältnis) in der Spiralarterien in diesen Mäusen höher, was auf verringerte Blutzufuhr und eine höhere Strömungsgeschwindigkeit des Blutes. Diese quantitative Bewertung wurde mit immunhistochemischen Nachweis von SMA bestätigt. Es ist charakteristisch für die WT-Mäusen, die meisten der SMA im Gefäß Medien verlierender Spiralarterien von der Mitte der Schwangerschaft. Wenn dieser NK-Zell-gesteuerten Prozess nicht stattfindet, bleibt SMA in den Medien der Gefäße und kann leicht immunhistochemisch wie Ringe um die Blutgefäße (Abbildung 3) festgestellt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Abbildung 1: Maus-Uterus bei gd9.5, schematische Übersicht Zeichnung, die die relativen Positionen des Uterushörner, Zervix (blau) und Hauptgebärmutterarterien (rot).. Angegeben ist jeweils die lange Achse des Uterushorns (Pfeile) und die Ligationspunkte (gestrichelte Pfeile). Die Abschnitte für die Immunhistochemie entlang der Sichtebene geschnitten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Abb. 2: stereo Beurteilung der arteriellen Umbau an der Mitte der Schwangerschaft (A) Beispiel assessment der luminalen und Gesamtgefäß Bereiche auf H &amp; E-gefärbten Schnitten von WT Frauen im mittleren 2/4 der Dezidua basalis (durch die vertikale schwarze abgegrenzt gestrichelte Linien) bei gd9.5. In den Gefäßen bei höherer Vergrößerung, gestrichelte rote Linie abgrenzt Gesamtgefäßfläche, gelb gestrichelte Linie abgrenzt Lumenfläche. Bar = 500 &amp; mgr; m (links), 50 &amp; mgr; m (rechts). Die lange Achse des Uterus ist eine horizontale Linie in dieser Ausrichtung. (B) Quantifizierung der luminalen Bereiche (links) und das Verhältnis von Lumenfläche insgesamt Gefäßfläche (rechts) von WT (C57BL / 6) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse (auf C57BL / 6 Hintergrund). Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 15 Messungen (5 Messungen pro Abschnitt 3 Abschnitte pro Implantationsstelle). Balken stellen von n = 11-13 Implantationsstellen aus 4 Schwangerschaften pro Gruppe bedeuten; p-Wert aus einem zweiseitigen, ungepaarten Mann-Whitney-Test. WT: Wildtyp. <img alt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Abb. 3: Immunhistochemische Detektion von Glattmuskelaktin in der Dezidua basalis Vertreter SMA Färbung auf WT (oben) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen (auf C57BL / 6 Hintergrund, unten) an gd9.5. Bar = 100 &amp; mgr; m. WT: Wildtyp.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K Aufrufe.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Serie: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Forschung

Medizin

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Entwicklungsbiologie

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

Ist meine Maus schwanger? Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

Methoden zur Untersuchung des Beitrags der Gebärmutter zur Schwangerschaftsbegründung in einem ovariektomierten Mausmodell

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Einem Rattenmodell der milden Intrauterine Hypoperfusion mit Microcoil Stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Neurowissenschaften

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Sonographie in experimentellen reproduktiven Untersuchungen an Ratten

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Development of a Murine Model for Femoral Artery Anastomotic Stenosis

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent postoperative complication, primarily caused by surgery-induced vascular injury, intimal hyperplasia, and inflammatory responses. The mouse femoral artery anastomosis model is widely used to investigate the mechanisms of anastomotic restenosis and vascular repair. Microscopically guided end-to-end femoral artery anastomosis allows precise simulation of vascular injury and repair processes following surgery, providing a reliable experimental tool for studying the pathological mechanisms related to restenosis. This study focuses on refining the surgical technique for femoral artery anastomosis in mice. Through refinements in surgical techniques and optimization of technical details, we have achieved a marked increase in the success rate and reproducibility of the model. Specific improvements include refined vascular handling techniques during surgery, the selection of suture materials, and the optimization of suturing methods to minimize anastomotic leakage and postoperative occlusion. The study also emphasizes the observation of intimal hyperplasia, vascular remodeling at the anastomotic site, and long-term vessel patency. Through this research, we provide a concise and efficient operational guide for performing mouse femoral artery anastomosis, offering reliable technical support for experimental studies in vascular surgery. This work lays a solid foundation for subsequent investigations into related mechanisms and evaluations of therapeutic intervention.

Here we present a murine model for femoral artery anastomosis, offering researchers a valuable animal model to study and simulate vascular anastomotic stenosis. This development is crucial for advancing our understanding of the pathophysiology underlying this condition and facilitating more accurate and effective research into vascular diseases.

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent ...