Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, eine Dialet-Schnittstelle Bilayer, oder DIB, Modellmembran präzise zu erwärmen, die es ermöglicht, eine Vielzahl von temperaturbedingten Effekten zu untersuchen, die in zellulären Umgebungen auftreten. Der Hauptvorteil ergibt sich aus der Möglichkeit, die Badtemperatur in einem Low-Volume-Reservoir lokal zu messen und zu steuern, ohne den Zugang zu den elektrischen oder optischen Charakterisierungen des DIB zu behindern. Die Fähigkeit, das Flüssigkeitsbad präzise zu erwärmen, eröffnet die Möglichkeit, die Transport- und Signaleigenschaften in DIBs zu untersuchen, die aus einer viel größeren Vielfalt von Membranbestandteilen, einschließlich natürlicher Zellextrakte, gebildet werden.
Dies ist ein mehrstufiges Protokoll, das mehrere Geräte nutzt, die genau befolgt werden müssen, um eine ausreichende experimentelle Genauigkeit zu erreichen, so dass jede Mehrdeutigkeit im schriftlichen Prozess durch visuelle Demonstration geklärt werden kann. Zu Beginn sammeln zwei Stücke von einem Millimeter dicken isolierenden Gummi auf 25 x 40 Millimeter Länge getrimmt, zwei Stücke eines sechs Millimeter dicken Gummis, die auch 25 x 40 Millimeter sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung Sondenbau, und ein Acrylöl-Reservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basisvorrichtung passt. Legen Sie die dünneren Gummistücke auf die Bühne des Mikroskops, so dass die lange Kante jedes Stückes tangential zur Bühnenöffnung ist.
Positionieren Sie die Aluminium-Basishalterung auf den isolierenden Pads mit dem Sichtfenster der Leuchte zentriert über der Objektivlinse. Legen Sie ein dickeres Stück Gummi auf jedes widerstandsfähige Heizelement und verwenden Sie einen Mikroskop-Bühnenclip, um es an Ort und Stelle zu halten, um die Heizelemente vor Schäden durch die Bühnenclips zu schützen und um vor versehentlicher elektrischer Kurzarbeit zu isolieren. Biegen Sie vorsichtig das Messende eines Thermoelements, um einen 90-Grad-Winkel bei etwa vier Millimetern vom Ende zu erreichen.
Setzen Sie die gebogene Spitze des Thermoelements in die linke untere Ecke der Aluminiumhalterung ein und befesteinzige Sie sie vorsichtig mit einer Verriegelungsschraube. Legen Sie das Acrylreservoir in den Brunnen der Aluminiumhalterung, bevor Sie dem Bohrkorb der Aluminiumhalterung Hexadecanöl hinzufügen, um das Risiko zu minimieren, Luftblasen zwischen dem Sichtfenster und dem Boden des Acrylbehälters einzufangen. Geben Sie etwa 1.000 Mikroliter Hexadecanöl in den Brunnen der Aluminiumhalterung, um eine maximale Oberfläche für die Wärmeübertragung zu bieten, ohne dass Öl über die Ränder der Leuchte auf die Mikroskopbühne oder objektive Linse austreten kann.
Ca. 1.000 Mikroliter Hexadecanöl in das Acrylreservoir geben, ohne es zu überfüllen. Messen Sie die Nominelle Kapazität der Membran und senken Sie gleichzeitig die Temperatur des Ölbades von einem Sollwert, der die Bilayerbildung ermöglicht, thermotrope Phasenübergänge der Lipide in der Membran zu identifizieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Temperaturdiagramm auf der GUI, und löschen Sie die Anzeigedaten, um sicherzustellen, dass genügend Platz im Puffer für nachfolgende Aufnahmen zur Verfügung steht.
Wenden Sie mit dem an den Patchklemmenverstärker angeschlossenen Wellengenerator eine dreieckige Spannungswellenform über die Tröpfchenschnittstelle Bilayer oder DIB-Elektroden an und zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion durch die Bilayer auf. Kühlen Sie die Doppelschicht, indem Sie die Solltemperatur in Fünf-Grad-Schritten reduzieren und bei der neuen Konstanttemperatur zwischen Temperaturänderungen mindestens fünf Minuten warten, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist. Nach dem Ölbad und dem Abkühlen der Bilayer auf die gewünschte Mindesttemperatur, klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf das Temperaturdiagramm in der GUI und exportieren Sie die Temperaturdaten im Vergleich zur Zeit in eine Tabellenkalkulationssoftware.
Beenden Sie die aktuelle Aufzeichnung. Berechnen Sie aus dem gemessenen Strom die nominale Kapazität der quadratischen Wellenstromantwort im Vergleich zur Zeit während der Kühlperiode. Plotten Sie die nominale Kapazität versus Temperatur, um zu beobachten, wie sich die Membrankapazität veränderte, und lokalisieren Sie dann nicht-monotone Veränderungen der Kapazität im Vergleich zur Temperatur, um die Schmelztemperatur zu identifizieren.
In ähnlicher Weise bewerten Sie die quasi statisch-spezifische Kapazität der Bilayer bei festen Temperaturen, indem Sie die Temperatur des Ölbades und des Doppelschichtbereichs sukzessive erhöhen. Ändern Sie die Solltemperatur in 10-Grad-Celsius-Schritten mit der GUI und ermöglichen Sie dem System, sich mit der neuen Temperatur auszurichten. Führen Sie zuvor beschriebene Schritte aus, um die Messung des kapazitiven Stroms und der Aufzeichnung zu initiieren.
Ändern Sie den Bilayer-Bereich, indem Sie die Positionen der Elektroden mit den Mikromanipulatoren sorgfältig anpassen. Ermöglichen Sie es, dass der quadratische Wellenstrom eine stationäre Amplitude erreicht und Bilder des DIB sammelt, um die Berechnung der Membranfläche im Vergleich zur Zeit zu ermöglichen. Verwenden Sie eine am Mikroskop montierte Kamera, um die Bilayer aus der Blende zu fotografieren.
Fügen Sie der aktuellen Aufnahmesoftware gleichzeitig ein digitales Tag hinzu, um den entsprechenden Zeitpunkt für die Bildsammlung zu markieren. Erhalten Sie insgesamt fünf DIB-Bilder und stationäre Bereiche des Bilayer-Stroms, setzen Sie dann die Temperatur zurück und wiederholen Sie die Bildgebung. Analysieren Sie die aktuellen Aufzeichnungen und DIB-Bilder an den markierten Zeitpunkten, die den stationären Bilayer-Bereichen entsprechen, extrahieren Sie die zweischichtige Kapazität und die Fläche für jede Temperatur.
Plotten Sie Kapazität im Vergleich zu Fläche für jede Temperatur und berechnen Sie die Steigung der Regression erster Ordnung, die die spezifische Kapazität des Doppellayers bei jeder Temperatur darstellt. Zeichnen Sie dann Werte bestimmter Kapazität im Vergleich zu ihren jeweiligen Temperaturen. Untersuchen Sie die spezifischen Kapazitäts- und Temperaturdaten auf nicht-monotone Schwankungen, um Schmelztemperaturen zu identifizieren.
Bewerten Sie die Dynamik der spannungsabhängigen Ionenkanalbildung, indem Sie einen DC-Spannungsschritteingang über die Bilayer generieren. Stellen Sie die Anfangsspannung auf den gewünschten Schrittwert in Millivolt und die Endspannung und Schrittgröße auf einen Wert höher als der gewünschte Schritt. Legen Sie die gewünschte Dauerzeit für die Schritteingabe in Sekunden fest, und wählen Sie dann die gewünschte Polarität für die Schritteingabe aus.
Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die Befehlsspannung aus der Laboransicht oder dem Spannungsausgangsmodul an die Kopfstufe zu senden, schalten Sie die Spannung ein und zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion auf, die eine S-förmige Reaktion auf eine kritische Spannung hemmen sollte. Erhalten Sie separat dynamische Stromspannungsbeziehungen für eine Membran bei gewünschten Temperaturen, um spannungsabhängige Beziehungen wie Ionenkanalverhalten aufzuzeigen. Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die vom Wellenformgenerator ausgehende Befehlsspannung an die Kopfstufe zu senden und Stromaufzeichnungen zu initiieren.
Geben Sie am Wellenformgenerator eine kontinuierliche sinusförmige Wellenform mit einer gewünschten Amplitude, Einem Offset und einer Frequenz aus. Zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion über einen oder mehrere Zyklen auf und wiederholen Sie sie nach Belieben für verschiedene Sinuswellenamplituden, Frequenzen und Temperaturen. Das Temperaturregelungssystem wurde verwendet, um die Temperaturabhängigkeit eines DIB zu zeigen, das aus dem Gesamtfettextrakt des Gehirns oder BTLE-Lipiden gebildet wird.
Messungen von kapazitivem Strom und Temperatur im Vergleich zur Zeit werden während eines Heizzyklus von Raumtemperatur bis ca. 60 Grad Celsius angezeigt. Veränderungen der Nennkapazität gegenüber der Temperatur über einen kompletten Kühl-/Heizzyklus nach anfänglicher Bilayerbildung bei 60 Grad Celsius wurden dokumentiert. Quasistatische Messungen spezifischer Kapazität bei unterschiedlichen Temperaturen können verwendet werden, um lipidschmelzende Temperaturen zu identifizieren.
Die Plotatitanz eines Bilayer-Gegen-Zweischichtbereichs ermöglicht eine lineare Regression, bei der die Neigung den Wert einer bestimmten Kapazität darstellt. Das DIB-Bild zeigt, dass die Membran, wenn die Temperatur unter der Schmelztemperatur liegt, einen hochklebenden Zustand annimmt, selbst unter Spannung von gestreckten Tröpfchen, die durch gut getrennte Elektroden verursacht werden. Die dargestellten Strom-Spannungs-Spuren wurden durch Anwendung sinusförmiger Membranspannungen ermittelt, die den induzierten Strom bei zwei verschiedenen Temperaturen messen.
Die Pfeile und nachfolgenden Zahlen helfen bei der Visualisierung der aufeinanderfolgenden Viertel der sinusförmigen Spannung in Bezug auf die Zeit. Die gemessene Stromdichte für eine monazomycindotierte BTLE-Membran auf dem gleichen Spannungsniveau und zwei unterschiedlichen Temperaturen wird hier gezeigt. Es ist wichtig, das Hexadecanöl richtig in den Brunnen der Aluminiumhalterung zu geben.
Wenn dies abl. oder nicht sorgfältig geschieht, bilden sich Luftblasen unter dem Acrylbrunnen, was die Bottom-up-Ansicht des DIB behindert. Der Benutzer muss auch daran denken, den Datenpuffer in der Temperaturregelungssoftware vor jeder Messung zu löschen, um eine vollständige Aufzeichnung zu gewährleisten. Dieses Verfahren ermöglicht die Charakterisierung biomimetischer Membranen über einen Temperaturbereich hinweg, der zur Untersuchung der Temperaturabhängigkeit von Membranstruktur und -transport erforderlich ist.
Darüber hinaus könnte diese Fähigkeit genutzt werden, um nanoskalige Effekte anderer membranaktiver Arten, wie biologische Ionenkanäle und technisch hergestellte Nanomaterialien, aufzudecken.
