פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחמם במדויק bilayer ממשק טיפה, או DIB, קרום מודל, המאפשר לחקור מגוון רחב של השפעות הקשורות לטמפרטורה המתרחשות בסביבות הסלולר. יתרון הליבה נובע מהיכולת למדוד ולשלוט באופן מקומי בטמפרטורת האמבטיה במאגר בנפח נמוך מבלי לחסום את הגישה לאפיונים החשמליים או האופטיים של ה- DIB. היכולת לחמם במדויק את אמבט הנוזלים פותחת את האפשרות לחקור את תכונות ההובלה והאיתות ב- DIBs שנוצרו ממגוון רחב בהרבה של מרכיבי קרום, כולל תמציות תאיות טבעיות.
זהו פרוטוקול רב-שלבי הממנף ציוד מרובה שיש לעקוב אחריו מקרוב כדי להשיג דיוק ניסיוני מספיק, ולכן ניתן להבהיר כל עמימות בתהליך הכתוב באמצעות הדגמה חזותית. כדי להתחיל לאסוף שתי חתיכות של גומי בידוד עבה מילימטר אחד גזוז ל 25 על ידי 40 מילימטרים אורך, שתי חתיכות של גומי עבה שישה מילימטר כי הם גם 25 על ידי 40 מילימטרים, מכלול מתקן בסיס אלומיניום מוכן, מאגר שמן אקרילי שמתאים לחלון הצפייה של גוף בסיס אלומיניום. מניחים את חתיכות הגומי הדקות יותר על במת המיקרוסקופ כך שהקצה הארוך של כל חתיכה משיק לפתיחת הבמה.
מקם את גוף בסיס האלומיניום על גבי רפידות הבידוד עם חלון הצפייה של המתקן ממורכז מעל העדשה האובייקטיבית. מניחים חתיכת גומי עבה יותר על גבי כל גוף חימום התנגדותי, ולאחר מכן להשתמש קליפ שלב מיקרוסקופ להחזיק אותו במקום כדי להגן על אלמנטים חימום מפני נזק שנגרם על ידי מהדקי הבמה כדי לבודד מפני קצר חשמלי מקרי. בזהירות לכופף את קצה המדידה של thermocouple כדי להשיג זווית של 90 מעלות ב כארבעה מילימטרים מהסוף.
הכנס את הקצה הכפוף של התרמופול לפינה השמאלית התחתונה של גוף האלומיניום ואבטח אותו בעדינות באמצעות בורג נעילה. מניחים את המאגר האקרילי בבאר של מתקן האלומיניום לפני הוספת שמן הקסדקאן לבאר של גוף האלומיניום כדי למזער את הסיכון של לכידת בועות אוויר בין חלון הצפייה לתחתית המאגר האקרילי. לוותר על 1, 000 microliters של שמן הקסדקאן לתוך הבאר של מתקן אלומיניום כדי לספק שטח פנים מקסימלי להעברת חום להתרחש תוך מתן שמן לשפוך על הקצוות של המתקן על שלב מיקרוסקופ או עדשה אובייקטיבית.
מחלקים כ-1,000 מיקרוליטרים של שמן הקסדקאן לתוך המאגר האקרילי מבלי למלא אותו יתר על הערך. למדוד את הקיבוליות הנומינלית של הממברנה תוך הורדת הטמפרטורה של אמבט השמן מנקודת סט המאפשר היווצרות bilayer לזהות מעברי שלב תרמוטרופי של השומנים בקרום. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI ונקה את נתוני התצוגה כדי להבטיח ששטח מספיק במאגר יהיה זמין להקלטות הבאות.
באמצעות מחולל צורת הגל המחובר למגבר מהדק התיקון, החל צורת גל מתח משולש על פני bilayer ממשק טיפה, או DIB, אלקטרודות ולתעד את התגובה הנוכחית המושרה דרך bilayer. מצננים את הדו-שכבתית על ידי הפחתת טמפרטורת הנקודות במרווחים של חמש מעלות, וממתינים לפחות חמש דקות בטמפרטורת המצב היציב החדשה בין שינויי הטמפרטורה עד להשגת הטמפרטורה הרצויה. לאחר אמבט השמן וקירור הדו-שכבתי לטמפרטורת המינימום הרצויה, לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני על גרף הטמפרטורה ב- GUI וייצא את נתוני הטמפרטורה לעומת הזמן לתוכנת גיליון אלקטרוני.
הפסק את ההקלטה הנוכחית. מהזרם הנמדד, חשב את התפקוד הנומינלי של התגובה הנוכחית של הגל המרובע לעומת הזמן במהלך תקופת הקירור. עלילה קיבוליות נומינלית לעומת טמפרטורה כדי לבחון כיצד קיבוליות קרום השתנה, ולאחר מכן לאתר שינויים שאינם מונוטוניים קיבוליות לעומת טמפרטורה כדי לזהות טמפרטורת התכה.
באופן דומה, להעריך את קיבוליות סטטית ספציפית מעין של bilayer בטמפרטורות קבועות על ידי הגדלה רצופה של הטמפרטורה של אמבט השמן ואת אזור bilayer. שנה את טמפרטורת הנקודה במרווחים של 10 מעלות צלזיוס באמצעות ממשק המשתמש הגרפי ואפשר למערכת להשתוות לטמפרטורה החדשה. בצע שלבים שתוארו קודם לכן כדי ליזום מדידה של זרם והקלטה קיבוליים.
שנה את אזור הדו-שכבתי על-ידי כוונון קפדני של מיקומי האלקטרודות באמצעות המניפולטורים הזעירים. אפשר לזרם הגל המרובע להגיע משרעת מצב יציב ולאסוף תמונות של DIB כדי לאפשר חישוב של אזור קרום לעומת זמן. השתמש במצלמה המותקנת על המיקרוסקופ כדי לדמות את הדו-שכבתי כפי שניתן לראות מהצמצם.
הוסף בו-זמנית תגית דיגיטלית לתוכנת ההקלטה הנוכחית כדי לסמן את נקודת הזמן המתאימה לאיסוף תמונות. השג בסך הכל חמש תמונות DIB ואזורים במצב יציב של זרם דו-שכבתי, ולאחר מכן אפס את הטמפרטורה וחזור על ההדמיה. נתח את ההקלטות הנוכחיות ואת תמונות DIB בנקודות הזמן המתויגות המתאימות לאזורי bilayer במצב יציב, חילוץ קיבוליות bilayer ואזור עבור כל טמפרטורה.
תכנן קיבוליות לעומת אזור עבור כל טמפרטורה וחישב את השיפוע של רגרסיה מסדר ראשון, המייצג את היבול הספציפי של הדו-שכבתי בכל טמפרטורה. ואז להתוות ערכים של קיבוליות ספציפית לעומת הטמפרטורות המתאימות שלהם. בדוק את ההיבול הספציפי לעומת נתוני טמפרטורה עבור וריאציות לא מונוטוניות לזיהוי טמפרטורות נמסות.
להעריך את הדינמיקה של היווצרות ערוץ יון תלוי מתח על ידי יצירת קלט שלב מתח DC על פני bilayer. הגדר מתח התחלתי לערך הצעד הרצוי במילי-וולט ולמתח הסופי ולגודל הצעד לערך גבוה יותר מהשלב הרצוי. הגדר משך זמן רצוי עבור קלט השלב בשניות ולאחר מכן בחר את הקוטביות הרצויה עבור קלט השלב.
החלף את מגבר מלחצי התיקון כדי לשלוח את מתח הפקודה שמקורו בתצוגת מעבדה או מודול יציאת מתח לשלב הראש, הפעל את המתח והקלט את תגובת הזרם המושרה, שאמורה לעכב תגובה בצורת S למתח קריטי. השג בנפרד קשרי מתח זרם דינמיים עבור קרום בטמפרטורות הרצויות כדי לחשוף קשרים תלויי מתח כגון התנהגויות ערוץ היון. החלף את מגבר המהדק של התיקון כדי לשלוח את מתח הפקודה שמקורו במחולל צורת הגל לשלב הראש וליזום הקלטות זרם.
במחולל צורת הגל, פלט צורת גל סינוסואידית רציפה עם משרעת, היסט ותדירות רצויים. רשום את התגובה הנוכחית המושרה על-פני מחזור אחד או יותר וחזור על הפעולה הרצויה עבור משרעת, תדרים וטמפרטורות שונות של גלי סינוס. מערכת בקרת הטמפרטורה שימשה כדי להציג את התלות בטמפרטורה של DIB שנוצר תמצית השומנים הכולל במוח, או BTLE, שומנים.
מדידות של זרם קיבולי וטמפרטורה לעומת זמן מוצגות במהלך מחזור חימום מטמפרטורת החדר לכ-60 מעלות צלזיוס. תועדו שינויים בקיבוליות הנומינלית לעומת הטמפרטורה במחזור קירור/חימום שלם אחד, לאחר היווצרות דו-שכבתית ראשונית בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. מדידות מעין סטטיות של קיבוליות ספציפית בטמפרטורות שונות יכולות לשמש לזיהוי טמפרטורת המסת שומנים.
קיבוליות התוויית קוטלת לעומת אזור דו-שכבתי מאפשרת רגרסיה ליניארית, כאשר השיפוע מייצג את הערך של קיבוליות ספציפית. תמונת DIB מראה כי כאשר הטמפרטורה היא מתחת לטמפרטורת ההיתוך, הממברנה מאמצת מצב דבק מאוד, אפילו תחת מתח מטיפות מתוחות הנגרמות על ידי אלקטרודות מופרדות היטב. עקבות הזרם לעומת המתח שהוצגו התקבלו על ידי החלת מתחי קרום סינוסואידיים, מדידת הזרם המושרה בשתי טמפרטורות שונות.
החצים והמספרים הבאים מסייעים בהדמיה של רבעים רצופים של המתח הסינוסואידי ביחס לזמן. צפיפות הזרם הנמדדת לקרום BTLE מסומם monazomycin באותה רמת מתח ושתי טמפרטורות שונות מוצג כאן. זה חיוני כדי לוותר על שמן הקסדקאן לתוך הבאר של מתקן אלומיניום כראוי.
אם זה נעשה מתוך רצף או לא בזהירות, בועות אוויר ייווצרו תחת באר אקריליק, אשר יחסום את התצוגה מלמטה למעלה של DIB. המשתמש חייב גם לזכור לנקות את מאגר הנתונים בתוכנת בקרת הטמפרטורה לפני כל מדידה כדי להבטיח הקלטה מלאה. הליך זה מאפשר אפיון ממברנות ביומימטיות על פני מגוון של טמפרטורות, אשר יש צורך ללמוד תלות בטמפרטורה של מבנה קרום ותחבורה.
בנוסף, יכולת זו יכולה לשמש כדי לחשוף השפעות ננומטריות של מינים פעילים קרום אחרים, כגון תעלות יון ביולוגי ננו מהונדסים.
