Mehr als eine Million Uniformen aus den Tröpfchen werden auf dem fingergroßen Substrat hergestellt. Und einzelne DNA-Moleküle werden nach dem Zufallsprinzip in jedes Tröpfchen verteilt. Die Proteinausbeute ist proportional zur Anzahl der Moleküle in einem Tröpfchen.
Unsere Technik kann für eine schnelle und quantitative Messung der Enzymaktivität ohne komplizierte Proteinexpression und -reinigung eingesetzt werden. Um zu beginnen, legen Sie ein Deckglas auf ein Färbegestell und legen Sie das Rack in acht Mol Natriumhydroxid. Beschallen Sie das Deckglas und das Färberregal 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie das Färbegestell aus Natriumhydroxid und spülen Sie das Deckglas zehnmal mit Wasser ab. Trocknen Sie das Deckglas mit einer Luftpistole. Dann backen und trocknen Sie das Deckglas auf einer heißen Platte bei 200 Grad Celsius für fünf Minuten.
Bereiten Sie 0,05%Aminosilan-Lösung. Tauchen Sie das Deckglas in diese Lösung ein und inkubieren Sie es für eine Stunde bei Raumtemperatur. Spülen Sie das Deckglas fünfmal in reinem Wasser.
Dann trocknen Sie das Deckglas mit einer Luftpistole. Backen Sie es auf der heißen Platte bei 80 Grad Celsius für fünf Minuten. Legen Sie das Deckglassubstrat auf ein maßgeschneidertes Vakuumfutter für den Spincoater.
70 bis 90 Mikroliter CYTOP-Polymer vom Typ A in der Mitte des Glassubstrats verteilen. Dann sofort das Polymer verschichten. Die anfängliche Polymerbeschichtung beschädigt die Qualität des endgültigen Mikrokammer-Arrays.
Geben Sie das Polymer auf die Mitte des Deckglases, ohne Luftblasen einzuführen. Nehmen Sie das beschichtete Glas auf, indem Sie es an den Ecken halten und auf eine Aluminiumfolie legen. Backen Sie es für 30 Minuten bei 80 Grad Celsius und dann für eine weitere Stunde bei 200 Grad Celsius.
Geben Sie 0,2 bis 0,3 Milliliter Photoresist in der Mitte des Substrats. Drehen Sie den Photowiderstand sofort 60 Sekunden lang bei 6.000 U/min. Verwenden Sie ein mit Ethanol getränktes Tuch, um den überschüssigen Photoresist von den Rändern des Substrats zu entfernen.
Backen Sie das Substrat bei 110 Grad Celsius für fünf Minuten. Um den Photoresist zu rehydrieren, lassen Sie das Substrat 30 Minuten bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 42 bis 60% das Substrat in den Maskenausrichter laden und 25 Sekunden lang im Vakuumkontaktmodus aussetzen. Dann tauchen Sie das Substrat in Entwickler für fünf Minuten, um die exponierte Photoresist aufzulösen.
Spülen Sie das Substrat 10 Mal mit reinem Wasser. Dann trocknen Sie das Substrat gründlich mit der Luftpistole. Legen Sie das Substrat in die Reaktionskammer der Reaktiv-Ionen-Ätzmaschine und ätzen Sie den photoresist bedeckten CYTOP mit dem Sauerstoffplasma.
Nach dem Ätzen den restlichen Photoresist entfernen, indem Sie das Substrat in Aceton fünf Minuten lang bei Raumtemperatur beschallen. Dann beschallen Sie das Substrat in Propanol für fünf Minuten. Spülen, beschallen und spülen Sie das Substrat wieder mit reinem Wasser, wie in Manuskript beschrieben.
Dann trocknen Sie das Substrat mit einer Luftpistole. Schneiden Sie mit einem Desktop-Cutter doppelbeschichtetes Klebeband Kapton in die definierten Mikrokanalformen. Stecken Sie die geschnittenen Klebestücke in den Boden einer flachen Petrischale, um als Meister für das Formen des PDMS zu dienen.
Gießen Sie die PDMS-Mischung in die bandgemusterte Petrischale. Dann die Petrischale in eine Mini-Vakuumkammer geben und die PDMS-Mischung ein bis drei Stunden entweihen. Dann legen Sie die Petrischale in einen Ofen bei 60 Grad Celsius und lassen Sie sie über Nacht, um das PDMS zu heilen.
Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, schälen Sie das ausgehärtete Elastomer aus der Petrischale und schneiden Sie die PDMS-Mikrokanalblöcke mit einem Flachseilschneider aus. Dann schlagen Sie ein Loch an jedes Ende jedes Mikrokanals. Das zuvor vorbereitete Substrat wird einen Bereich für das Mikrokammer-Array haben.
Positionieren Sie den PDMS-Mikrokanal auf diesem Teil des Substrats. Legen Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in eine der Löcher im PDMS-Mikrokanal ein. Bereiten Sie zunächst die CFPS-Reaktionslösung in einem PCR-Rohr vor.
Dann, mit einer 200 Mikroliter Nicht-Filter Pipetspitze, erstellen Sie 10 Mikroliter der Lösung. Setzen Sie die Pipettenspitze in das Einlassloch des PDMS-Mikrokanals ein und drücken Sie auf den Pipettenkolben, bis die Lösung vom Mikrokanalauslass überläuft. Übertragen Sie das FemDA-Gerät auf einen vorgekühlten Aluminiumblock.
Vergewissern Sie sich, dass sich der Bereich des Mikrokammer-Arrays schnell von transluzent zu transparent dreht. Zeichnen Sie 300 Mikroliter vorgekühltes Spülöl und übertragen Sie das Öl sofort in die Pipettenspitze des Mikrokanaleinlasslochs. Das Spülöl bewegt sich in den Mikrokanal und extrudiert die überschüssige Reaktionslösung außerhalb der Mikrokammern.
Entfernen Sie gleichzeitig die beiden eingelegten Pipettenspitzen vom Gerät. Bewegen Sie das Gerät sofort vom Aluminiumblock in die Paraffinfolie. Legen Sie die vorbereitete Pipettenspitze, die das Dichtungsöl enthält, in den Einlass des PDMS-Mikrokanals ein und injizieren Sie das Öl, bis es aus dem Auslass überläuft.
Die Femtolitertröpfchen werden in einzelnen Mikrokammern durch das Öl versiegelt. Öffnen Sie das defokussierte BF-Bild. Um glatte kontinuierliche Hintergründe aus jedem Frame zu entfernen, wählen Sie Hintergrund aus dem Menü Prozess subtrahieren aus.
Geben Sie 20 für den rollenden Kugelradius ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Vorschau, und wählen Sie Okay aus. Wählen Sie Ja aus, wenn Sie gefragt werden, ob alle Bilder verarbeitet werden sollen.
Um das Rauschen zu reduzieren, wählen Sie Prozess, Filter, Median aus, um das Rauschen zu reduzieren. Geben Sie 2.0 für den Radius in Pixel ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Vorschau, und wählen Sie Okay aus.
Wählen Sie Ja aus, wenn Sie gefragt werden, ob alle Bilder verarbeitet werden sollen. Wählen Sie als Nächstes Bild, Anpassen, Schwellenwert aus, um die Bilder der Mikrokammern vom Hintergrund des Bildes zu trennen. Wählen Sie im Menü Plugins FemDA, FemDA Analysis aus.
Geben Sie die ungefähre minimale und maximale Anzahl von Pixeln einer einzelnen Mikrokammer ein. Die erwartete minimale und maximale Zirkularität der Mikrokammern und der Start- und Endrahmennummern, und wählen Sie dann ROI generieren aus, um die Mikrokammern zu erkennen. Die erfolgreich erkannten ROIs werden im Popupmenü ROITable angezeigt.
Wählen Sie im Fenster FemDA-Analyse die Option ROI-Maske anwenden aus. Untersuchen Sie das Bild, um festzustellen, ob die Mikrokammern ordnungsgemäß erkannt wurden. Öffnen Sie das Fluoreszenzbild und bringen Sie es nach vorne.
Klicken Sie erneut auf ROI-Maske anwenden, um die ROIs zum Fluoreszenzbild hinzuzufügen. Wählen Sie im Fenster FemDA-Analyse One-Shot aus, um Bildendpunktdaten zu analysieren. Geben Sie N für die Anzahl der oberen Pixel ein, um die Oberen-End-Pixel jedes ROI zu verwenden, um die mittlere Intensität des entsprechenden Tröpfchens zu berechnen.
Klicken Sie dann auf Intensität messen, um die mittleren Intensitäten aller erkannten Tröpfchen zu berechnen. Die ROITable wird mit den neuen Daten aus dem Fluoreszenzbild aktualisiert und das Histogramm wird in einem neuen Fenster angezeigt. Exportieren Sie die Daten, indem Sie auf die Schaltfläche Als Text speichern klicken.
Die fluoreszierende Lösung wurde in FemDA-Mikrokammern eingekapselt und die Fluoreszenzintensität, die mit der Tröpfchengröße korreliert, wurde mittels Mikroskopie gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Tröpfchen eine schmale Größenverteilung aufweisen. Das rekonstruierte 3D-Bild aus der konfokalen Mikroskopie zeigte auch die konsistente Tröpfchengröße im Laufe der Zeit.
Die Tröpfchen waren bei Raumtemperatur stabil, ohne Verdunstungsverlust oder Kreuzkontamination unter Tröpfchen für mindestens 24 Stunden. Das fluoreszierende Protein mNeonGreen wurde in FemDA synthetisiert. Und die Stapelbilddaten wurden mit Hilfe des gleichzeitigen defokussierten Hellfeldbildes analysiert.
Da die Fluoreszenzintensität jedes Tröpfchens an seiner Proteinausbeute gemessen wird, deutet das Histogramm stark auf eine ungleiche Anzahl von DNA-Molekülen pro Tröpfchen hin. Die Wahrscheinlichkeit, dass Tröpfchen unterschiedliche Anzahl von DNA-Molekülen enthielten, passte perfekt zu einer Poisson-Verteilung. Die Synthese des Enzyms alkalische Phosphatase wurde auch in FemDA mit Bildern durchgeführt, die alle fünf Minuten aufgenommen wurden.
Die Reaktion zeigte eine ähnliche diskrete Verteilung der Fluoreszenzintensität der Tröpfchen zu einem früheren Zeitpunkt und die Histogrammergebnisse bestätigten, dass die ungleiche Anzahl der DNA-Moleküle in den Tröpfchen. Einzelne DNA-Moleküle, die in einzelnen Tröpfchen verkapselt sind, können weiter zurückgewonnen, verstärkt und sequenziert werden, um ein Screening höchster Proteine zu ermöglichen. Eine Tröpfchentechnik mit geringem Volumen und entweder hoher Stabilität ermöglicht eine schnelle und präzise molekulare Diagnose von Krebserkrankungen mit spezifischen Biomarkern.
