Dieses Protokoll setzt Krebszellen in einer Suspension kurzen Impulsen von Flüssigkeitsscherstress aus, um bestimmte Aspekte davon nachzuahmen, wie metastasierende Krebszellen hämodynamischen Kräften ausgesetzt sind, während sie sich im Kreislaufsystem befinden. Es ist eine relativ einfache Technik, kurze Impulse mit hoher Flüssigkeitsscherspannung anzuwenden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, seien Sie vorsichtig mit unverschlossenen Nadeln und biegen Sie sie nicht, da dies die angewendete Kraftscherspannung ändert.
Dieses Verfahren kann Aerosole erzeugen, also verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen. Geben Sie zunächst 70 bis 90% konfluente PC3-Zellen aus der Gewebekulturschale frei, indem Sie das Wachstumsmedium absaugen und die 10-Zentimeter-Schüssel mit fünf Millilitern Kalzium und magnesiumfreiem PBS waschen. Dann saugen Sie das PBS an und fügen Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu.
Beobachten Sie nach der Trypsinisierung die Ablösung der Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop. Um das Trypsin zu hemmen, fügen Sie fünf Milliliter DMEM / F12-Medium hinzu, das 10% FBS enthält. Als nächstes legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen und bestimmen die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für drei Minuten, saugen Sie dann den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in einem serumfreien Gewebekulturmedium. Schneiden Sie den Boden des 14-Milliliter-Polystyrolrohrs an der Sieben-Milliliter-Linie um und legen Sie die Mischzellsuspension in das geschnittene Rohr. Sammeln Sie separat statische Kontrollproben von Zellen vor der Belastung durch Flüssigkeitsscherstress, um sie für die Durchführung von Assays zu verwenden.
Um die verbleibende Zellsuspensionsprobe einer Flüssigkeitsscherspannung auszusetzen, ziehen Sie die Zellsuspension in eine Fünf-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 30-Gauge-Halbzollnadel. Legen und befestigen Sie die Spritze mit einer unverschlossenen Nadel auf einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate ein, um die gewünschte Flüssigkeitsscherspannung zu erreichen. Führen Sie die Spritzenpumpe aus und sammeln Sie die scherte Probe im geschnittenen Röhrchen in einem Winkel von etwa 45 Grad, um das Schäumen zu reduzieren.
Entfernen Sie die Spritze vorsichtig von der Spritzenpumpe und entfernen Sie die Nadel mit einer Zange, wobei Sie darauf achten, sie nicht zu berühren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Zellsuspension der gewünschten Anzahl von Impulsen der Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt wurde. Führen Sie Lebensfähigkeitstests mit den statischen Proben durch, bevor Die Zellen einer Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt werden.
Für enzymatische Assays werden 100 Mikroliter Aliquoten aus den statischen Proben dupliziert in eine 96-Well-Platte übertragen. Sammeln Sie dann 100 Mikroliter Proben nach Der Belastung durch Flüssigkeitsscherung und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 20 Mikroliter einer Resazurinlösung von 0,15 Milligramm pro Milliliter zu jeder Probenbohrung und zu Vertiefungen mit 100 Mikrolitern Medium allein hinzu.
Inkubieren Sie die Wellplatten zwei Stunden lang im 37 Grad Celsius gewebekulturellen Inkubator, messen Sie dann die Fluoreszenz und Absorption mit einem Plattenleser und erhalten Sie den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen, indem Sie das durchschnittliche Signal von jeder der Flüssigkeitsscherstress-exponierten Proben mit der durchschnittlichen bis statischen Kontrollprobe vergleichen. Sammeln Sie in ähnlicher Weise Aliquoten aus statischen Proben, um Durchflusszytometrie und klonogene Assays durchzuführen, wie im Textmanuskript beschrieben. In der repräsentativen Analyse wurde die Lebensfähigkeit von syngenen Biopsie-Brustepithelkrebszellen mit Hilfe der Resazurin-Umwandlung beurteilt, nachdem Zellen einer Reihe von Flüssigkeitsscherstressimpulsen ausgesetzt wurden.
Obwohl jede Zelllinie unterschiedliche Widerstandsprofile aufwies, gab es nach 10 Impulsen der Flüssigkeitsscherstressbelastung keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit. Zusätzliche Krebszelllinien aus einer Vielzahl von Gewebeursprüngen zeigten die Lebensfähigkeit von mehr als 20% nach 10 Impulsen von Flüssigkeitsscherstress, mit Ausnahme von MIA PaCa-2-Zellen, die aufgrund der Empfindlichkeit gegenüber mechanischer Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress eine Lebensfähigkeit von weniger als 10% zeigten. Wenn Sie die statische Probe vor dem Auftragen der Scherspannung der Flüssigkeiten sammeln, stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension homogen gemischt ist.
Entfernen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Zange und biegen oder berühren Sie die Nadel nicht. Neben der Messung der Zelllebensfähigkeit kann man Veränderungen in der Genexpression, Zellsignalisierung, Proliferation und Migration bewerten. Anhand dieses Modells für die Exposition gegenüber Flüssigkeitsscherstress kann man sowohl untersuchen, wie Krebszellen der Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress widerstehen, als auch die Auswirkungen von Flüssigkeitsscherstress auf die Biologie von Krebszellen bewerten.
Diese Technik wurde von unserem Labor und anderen verwendet, um die Auswirkungen von Flüssigkeitsscherstress auf zirkulierende Tumorzellen zu untersuchen. Diese Studien haben gezeigt, dass Flüssigkeitsscherstress die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen schnell verändert und dass dies zur Fähigkeit von Krebszellen beiträgt, der Zerstörung durch Flüssigkeitsscherstress zu widerstehen.
