Der Cofaktor F420 spielt eine wichtige Rolle im Primär- und Sekundärstoffwechsel vieler Prokaryoten. Die Messung dieses Moleküls in Umweltproben ermöglicht ein tieferes Verständnis seiner Prävalenz und Funktion. Diese Technik ermöglicht die Analyse des Cofaktors in schwierigen Probenmaterialien wie Schlamm und Boden.
Dabei sind die Lyse des Materials und die Vorreinigung vor der Analyse die zentralen Schritte. Das Protokoll umfasst verschiedene Schritte während der Probenvorbereitung. Diese Schritte müssen sehr gut geplant und vorbereitet werden, bevor mit der Probenbearbeitung begonnen wird.
Zum Beispiel ist die Vorbereitung von frischen Puffern wichtig. Um mit der Probenlyse zu beginnen, legen Sie fünf Gramm der Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Dann fügen Sie fünf Milliliter 2X Lysepuffer zu den Proben hinzu und bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 10 Milliliter, um eine Endkonzentration von 0,5 Gramm pro Milliliter zu erreichen.
Wirbeln Sie die verdünnten Proben für 20 Sekunden vor, gefolgt von einem Autoklavieren für 30 Minuten bei 121 Grad Celsius. Für trockene Proben wie Waldboden nach dem Autoklavier mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 Millilitern bringen und die verdünnte Probe wie gezeigt erneut für 20 Sekunden wirbeln. Sobald die Proben abgekühlt sind, zentrifugieren Sie das Probenlysat für fünf Minuten bei 11.000 x g und sammeln Sie den Überstand.
Bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Festphasenextraktion oder SPE-Säule vor, die mit 100 Milligramm schwachem Anionen-Mixed-Mode-Polymersorbens gefüllt ist und den Anionenaustauscher mit drei Millilitern Methanol konditioniert. Dann den Anionenaustauscher mit drei Millilitern destilliertem Wasser ausgleichen. Laden Sie bis zu neun Milliliter des Überstandes aus dem zentrifugierten Lysat auf die SPE-Säule.
Waschen Sie die Verunreinigungen nacheinander aus der Säule mit fünf Millilitern 25-Millimol-Ammoniakacetat und fünf Millilitern Methanol. Nach dem Waschen den Cofaktor F420 mit einem Milliliter Elutionspuffer eluieren. Stellen Sie den Ofen auf 40 Grad Celsius ein und stellen Sie den Fluoreszenzdetektor auf 420 Nanometer Extinktionswellenlänge und 470 Nanometer Emissionswellenlänge ein.
Als nächstes filtern Sie die eluierte Probe aus der SPE in HPLC-Fläschchen mit einem PTFE-Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern. Injizieren Sie 50 Mikroliter der gefilterten Probe in das HPLC-System und trennen Sie den Cofaktor F420 über den Gradientenmodus unter Verwendung einer Kombination mobiler Phasen, wie im Manuskript beschrieben. Analysieren Sie die Zusammensetzung und Konzentration des Cofaktors F420.
Das Wachstum von Reinkulturen von Methanogenen wurde durch Mikroskopie nachgewiesen. In der Phasenkontrastmikroskopie sind Agglomerate von Methanogenen sichtbar, die ein bläuliches Licht emittieren, wenn der Cofaktor F420 mit ultraviolettem Licht angeregt wird. Die Peakfläche des zurückgewonnenen Cofaktors F420 nach SPE mit unterschiedlichen Volumina der Methanoculleus thermophilus Kulturen wurde analysiert.
Die Autoklavierungsstrategie erreichte die höchste Spitzenfläche und schloss die maximale Extraktionseffizienz durch eine Druck-Temperatur-Behandlung ab. Die Analyse der Schwanzlängenverteilung ergab die Unterschiede in der Gesamtkonzentration des Cofaktors F420 und der Verteilung der F420-Schwanzlänge der reinen methanogenen Kulturen in Umweltproben. Achten Sie bei der Anwendung dieses Verfahrens darauf, das Gesamtvolumen des Elutionspuffers vollständig zu erfassen oder das genaue Volumen des Durchflusses aufzuzeichnen.
Diese Technik ebnet den Weg für die Erforschung des Cofaktors F420 in komplexeren Proben wie Böden und Schlämmen und ermöglicht tiefere Einblicke in die ökologischen Auswirkungen dieses Moleküls.
