Die TR-FRET-basierten Assays bieten neue kostengünstige Werkzeuge für das Screening und die pharmakologische Charakterisierung spezifischer und selektiver Modulatoren der JAK/STAT-Signalwege. Diese Technik ist viel einfacher, schneller, reproduzierbar und robust als herkömmliche Methoden wie Western Blot und ELISA. Es sind keine Waschschritte erforderlich und Reagenzien werden in einem einzigen Schritt zugegeben.
Diese Immunoassay-Plattform kann leicht auf andere Zellsignalproteine angewendet werden, sofern spezifische Antikörper verfügbar sind. Um reproduzierbare Assays zu entwerfen, müssen Sie gute Zellkulturpraktiken anwenden und Standardarbeitsanweisungen festlegen. Darüber hinaus müssen Sie die Zellkultur- und Behandlungsbedingungen sorgfältig optimieren.
Das Verfahren wird von Genevieve Chatel, einer Wissenschaftlerin aus unserem Labor, demonstriert. Zu Beginn kultivieren HeLa- und A431-Zellen in einem befeuchteten 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit DMEM, ergänzt mit 10% FBS. Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, trypsinisieren Sie sie und entweder passieren oder verwenden Sie sie für Assays.
Um den Assay durchzuführen, dosieren Sie 50 Mikroliter Zellen in der voroptimierten Dichte in eine 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte im entsprechenden Kulturmedium und inkubieren Sie sie dann über Nacht in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator. Bereiten Sie am folgenden Tag eine zweifache und vierfache Verdünnungsreihe der Testverbindungen vor, indem Sie die Verbindung in einem serumfreien Medium über 12 Vertiefungen einer Polypropylen-96-Well-Platte seriell verdünnen. Für die Zellstimulation fügen Sie 50 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, das den Simulator in einer 2-fachen Konzentration enthält, und inkubieren Sie die Zellen für die voroptimierte Zeit entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad.
Für die Zellinhibition 25 Mikroliter serumfreies Medium, das den Inhibitor in einer 4-fachen Konzentration enthält, hinzufügen und die Zellen für die voroptimierte Zeit entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad inkubieren, dann 25 Mikroliter serumfreies Medium, das den Stimulator in einer 4-fachen Konzentration enthält, hinzufügen und für die voroptimierte Zeit inkubieren. Als nächstes, um die Zellen zu lysieren, bereiten Sie den 1X ergänzten Lysepuffer vor und fügen Sie ihm einen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail hinzu. Nach vorsichtigem Entfernen und Entsorgen des Zellkulturmediums sofort 50 Mikroliter des vorbereiteten 1X ergänzten Lysepuffers zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln mit mäßigem Rühren inkubieren.
Für den TR-FRET-Nachweis bereiten Sie die 4X-Antikörper-Detektionsmischung im 1X-Nachweispuffer vor, dann die EUAB1- und FRAB2-Antikörperlösungen sowie die EUAB3- und FRAB4-Antikörperlösungen im 1X-Nachweispuffer. Mischen Sie schließlich vorverdünntes EUAB1 mit vorverdünntem FRAB2 zum Nachweis von Phosphoprotein und vorverdünntem EUAB3 und vorverdünntem FRAB4 zum Nachweis von Gesamtprotein. Dann pipettieren Sie vorsichtig 15 Mikroliter des Zelllysats von der 96-Well-Kulturplatte zu einer Vertiefung einer weißen, 384-Well-Mikroplatte mit geringem Volumen.
Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter des Positivkontrolllysats und 15 Mikroliter 1X Lysepuffer als Negativkontrolle hinzu, um die Assay-Bohrlöcher zu trennen. Zu Vertiefungen, die 15 Mikroliter des Lysats enthalten, fügen Sie fünf Mikroliter der entsprechenden 4X-Antikörper-Detektionsmischung hinzu, um das Phosphoprotein oder das Gesamtprotein nachzuweisen. Nachdem Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler bedeckt haben, inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bis über Nacht, abhängig vom Assay-Kit.
Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie den selbstklebenden Plattenversiegeler und lesen Sie die Platte auf einem TR-FRET-kompatiblen Mikroplattenleser. Die Ergebnisse von TR-FRET-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Phospho-STAT1 mit Gesamt-STAT1 und Phospho-STAT4 in U266B1-Zellen zusammen mit Phospho-STAT5 mit Gesamt-STAT5 in A431-Zellen werden mithilfe von Konzentrations-Response-Kurven dargestellt. In ähnlicher Weise werden TR-FRET-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Phospho-STAT3 und Gesamt-STAT3 und Phospho-STAT6 und Gesamt-STAT6 in HeLa-Zellen mithilfe von Konzentrationsantwortkurven dargestellt.
Insgesamt zeigten alle Assays robuste TR-FRET-Signale, große Dynamikbereiche, geringe Schwankungen des Inter-Well-Koeffizienten und akzeptable Signal-Hintergrund-Verhältnisse. Die Behandlung von Zellen mit JAK-Aktivatoren, Interferon alfa-2B und IL-4 und EGF zeigte den erwarteten konzentrationsabhängigen Anstieg der STAT-Phosphorylierung bei spezifischen Tyrosinresten, während die entsprechenden Gesamt-STAT-Proteine stabil blieben. Sowohl JAK-Inhibitor als auch Erlotinib hemmten die entsprechenden Phospho-STAT-Spiegel konzentrationsabhängig.
Die Ergebnisse der Phospho-STAT4-Stimulation durch Interferon alfa-2B in einer Suspensionszelllinie oder der Phospho-STAT6-Stimulation durch IL-4 in einer Adhärenzzelllinie unter Verwendung des Ein-Platten-Protokolls stimmten mit denen überein, die mit dem Zwei-Platten-Protokoll erzielt wurden, und zeigten somit eine erfolgreiche Anpassungsfähigkeit eines Zwei-Platten-Transferprotokolls an ein Ein-Platten-All-in-One-Well-Protokoll. Die Ergebnisse der Intraplattenvariabilitätsstudie für den Phospho-STAT1-Assay unter Verwendung einer Suspensionszelllinie und den Phospho-STAT3-Assay unter Verwendung einer Adhärenzzelllinie zeigen die Robustheit dieser Phospho-STAT-Assays für HTS-Anwendungen. Es ist wichtig, den Lysepuffer mit dem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail zu ergänzen, um eine Dephosphorylierung der phosphorylierten Proteine aus aktiver Phosphatase zu verhindern, die im Ganzzellextrakt vorhanden ist.
