Wir haben eine FRET-Mapping-Methodik entwickelt, die die Identifizierung und Charakterisierung von Ligandenbindungsstellen, Untereinheitenorientierung, Konformationsänderungen im Zusammenhang mit der Ligandenbindung und dynamischen Bewegungen von Proteinen ermöglicht. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie in Lösung durchgeführt werden kann und die Moleküle sich frei bewegen können. Die mit dieser Technik gemessenen Entfernungen sind für biologische Systeme geeignet.
FRET ist weitgehend auf viele Systeme anwendbar. Die Kartierung verbessert die Überwachung struktureller und dynamischer Veränderungen in jedem biomolekularen System und ist besonders effektiv, wenn dreidimensionale Strukturinformationen vorhanden sind. Nach der Reinigung des Proteins ist der schwierigste Teil das Markieren mit hoher Effizienz und das Entfernen des freien Farbstoffs.
Für die Experimente hilft es, so wenig freien Farbstoff wie möglich zu haben. Wählen Sie zunächst Markierungsstellen innerhalb von 25 bis 75 Angström der Strafbindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins. Der Abstand bestimmt das spezifische FRET-Farbstoffpaar, das verwendet werden soll.
Lokalisieren Sie die Markierungsstellen in Proteinregionen, die sich relativ voneinander unterscheiden. Die Standorte beschreiben also die Eckpunkte eines Dreiecks, wobei sich die Strafbindungsstelle in der Mitte befindet. Um die R0-Werte zu messen, bereiten Sie je nach gewünschter Küvettengröße und -volumen zwei Proteinproben mit der gleichen Konzentration des Gesamtproteins vor.
Eines mit dem Protein, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, und eines mit dem Protein, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Schalten Sie das Fluorometer ein und öffnen Sie das Spektralerfassungs- und Analyseprogramm in der FluorEssence-Software, wenn Sie ein Spektrofluorometer verwenden. Klicken Sie auf das rote M, um den Computer mit dem Gerät zu verbinden, und wählen Sie Emissionsspektren.
Geben Sie über das Menüelement Experiment erfassen Scanparameter ein, z. B. Anregungswellenlänge, den Bereich für den Emissionsscan, Temperatur und Probenänderung Ihrer Position. Klicken Sie auf RTC und optimieren Sie die Instrumenteneinstellungen, wie im Manuskript beschrieben, indem Sie die Fluoreszenzemission am Peak mit einer Anregungswellenlänge überwachen, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs eingestellt ist. Legen Sie die vom Spender markierte Proteinprobe in den Probenhalter und klicken Sie auf Ausführen, um einen Emissionsscan des Proteins zu erstellen, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, indem Sie die Probe am Farbstoffabsorptionsmaximum anregen und über die Emissionsspitze scannen.
Legen Sie eine Baseline für den Scan fest, indem Sie den Scan um 25 bis 50 Nanometer über das Ende des Peaks hinaus verlängern. Messen Sie die Quantenausbeute des reinen Spenderproteins, indem Sie Absorptions- und Fluoreszenzmessungen an Proben unterschiedlicher Konzentration durchführen, wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie nur Spenderprotein, Akzeptorprotein und Spender-Akzeptor-Proteinproben in der gleichen Konzentration vor.
Holen Sie sich den Spenderscan, um Fluoreszenzemissionsspektren zu erzeugen. Stimulieren Sie die Lösung am maximalen Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs und scannen Sie die Abgaben- und Akzeptoremissionsspitzen. Tauschen Sie entweder die Probe gegen das Akzeptorprotein aus oder ändern Sie die Probe ändern Sie Ihre Position in die Küvette, die nur das Akzeptorprotein enthält.
Erhalten Sie einen Emissionsscan des Proteins, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Stimulieren Sie die Probe bei der Wellenlänge der Spenderanregung. Tauschen Sie die Probe gegen die Spender-Akzeptor-Proteinprobe aus oder ändern Sie die Probe ändern Sie Ihre Position in die Küvette, die das mit dem Spender-Akzeptor markierte Protein enthält.
Erhalten Sie einen Emissionsscan der Spender-Akzeptor-Proteinprobe mit den gleichen Einstellungen. Korrigieren Sie für alle Spektren die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die am Ende des Scans gemessenen Hintergrundzahlen subtrahieren. Verwenden Sie ein grafisches 3D-Betrachtungsprogramm wie PyMOL, um die Entfernungen auf die Struktur abzubilden, indem Sie die Befehle aus dem Skript direkt in das Befehlsfenster mit den entsprechenden Abstandsinformationen eingeben.
Generieren Sie eine Shell für jede gemessene Entfernung und den zugehörigen Fehler. Bilden Sie die Position durch den Schnittpunkt der verschiedenen Schalen ab. Die Signalpeptid-Bindungsstelle wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Positionen auf SecA und SecYEG und vier verschiedenen Positionen auf dem Signalpeptid kartiert.
FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen auf den SecA- und SecYEG-Proteinen bilden die Präproteinbindungsstelle und -orientierung ab. Die Strafbindungsstelle des Signalpeptids wurde zuvor als Zwei-Helix-Finger identifiziert, und der SecA C-terminale Schwanz schlug eine Orientierung parallel zum Zwei-Helix-Finger vor. Steady-State-FRET-Spektren zwischen SecA37 und PhoA2 und PhoA22 wurden erhalten.
Die Verringerung der Spenderintensität deutete darauf hin, dass eine größere Energie von PhoA22 übertragen wird. Relativ zum PhoA2-Standort, der weiter von SecA37 entfernt liegt. Zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfallsspektren zeigten, dass der Donor-Akzeptor-Komplex einen kürzeren homogenen Zerfall aufweist, der mit einem Energietransfer übereinstimmt, der mit einer Entfernung verbunden ist.
FRET-Distanzschalen, die zwischen dem SecA-PhoA2-Rest und den triangulierten Stellen konstruiert wurden, zeigten, dass sich jede Schale mit dem Zwei-Helix-Finger, der angenommenen Bindungsstelle, schneidet, die grün dargestellt ist. Der Schnittbereich ist kleiner als jede FRET-Schale und enthält einen großen Beitrag des spiralförmigen Gerüsts. FRET-Distanzschalen, die zwischen dem PhoA2-Rückstand und den markierten Stellen bestimmt werden, beschreiben einen kleineren Bereich, der sich näher an der Spitze des Zwei-Helix-Fingers und der Mündung des SecYEG-Kanals befindet.
Dieser sich kreuzende Bereich befindet sich am gegenüberliegenden Ende des Zwei-Helix-Fingers von PhoA2. Zu den wichtigen Dingen, die zu berücksichtigen sind, gehört die richtige Auswahl der Kennzeichnungsstellen, um den Interessenbereich zu triangulieren, die Quantenausbeuten für jeden Standort zu messen und den gesamten freien Farbstoff zu entfernen. Diese Methode stimmt mit Strukturinformationen überein, die mit Methoden wie NMR oder Röntgenkristallographie erhalten wurden.
Wenn die FRET-Ergebnisse in einen strukturellen Kontext gestellt werden, können die vorhandenen Informationen verbessert werden.
