Hier haben wir das Protokoll zur Gewinnung und Erhaltung der guten und lebensfähigen Zellen für die Verwendung von therapeutischen Schritten, wie der Infusion von pluripotenten mesenchymalen Zellen, demonstriert. Der Hauptvorteil dabei ist, dass wir mit dieser Technik das lebensfähige Zellvolumen über die Zeit erhalten können, die im Isolierungsschritt der Zellen aus dem gesammelten Gewebe gewonnen wird. Diese Technik kann auf alle Krankheiten oder Zustände ausgedehnt werden, bei denen heterogene Medizin und Zelltherapie angewendet werden.
Diese Methode kann auch auf zytogenomische Stabilitätstests in Bereichen wie Drogentests angewendet werden, in denen langfristige Zellkulturen gefördert werden können. Wenn Sie die lebenden Zellen manipulieren, seien Sie ruhig und zuversichtlich. Seien Sie extrem vorsichtig mit Sepsis und seien Sie ständig wachsam mit den Augen eines Wissenschaftlers, um Widrigkeiten zu beobachten und gute Entscheidungen zu treffen.
Beginnen Sie mit dem Wiegen des Beutels und messen Sie die Temperatur mit einem digitalen berührungslosen Infrarot-Klinikthermometer. Lassen Sie den Beutel fünf Minuten lang in der Laminar-Flow-Kammer, um die fettigeren Schichten auszufällen und das Gewebe mit den Zellen zu trennen. Injizieren Sie 100 Milliliter DPBS mit Kalzium in den Transferbeutel und mischen Sie ihn mit den Händen.
Lassen Sie es fünf Minuten stehen. Verwenden Sie dann eine 60-Milliliter-Spritze, die am Beuteladapter befestigt ist, um den größten Teil der Basalflüssigkeit zu entsorgen, die ausfällt. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
Geben Sie 100 Milliliter der Verdauungslösung in den Beutel und lassen Sie ihn 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter langsamem Rühren. Dann den gesamten Inhalt des Beutels in vier 50-Milliliter-Konikusröhrchen geben und bei 400G für 10 Minuten bei 22 Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 5 Milliliter DMEM niedrige Glukose, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, zum Zellpellet hinzu.
Mischen Sie eine frische Lösung von 10 Mikrolitern Trypanblau bei 0,05% in destilliertem Wasser mit 10 Mikrolitern Zellsuspension für fünf Minuten. Verwenden Sie ein Inverslichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung und zählen Sie die lebensfähigen Zellen in einer Neubauer-Zellzählkammer. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem kryoschützenden Medium bei einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter.
Dann 1 Milliliter dieser Mischung in Kryofläschchen geben. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter mit einer Kühlgeschwindigkeit von 1 Grad Celsius pro Minute und lagern Sie ihn ein Jahr lang bei 80 Grad Celsius. Lagern Sie es nach einem Jahr in Standard-Kassettenboxen, die in flüssige Stickstoffdampfphase eingetaucht sind.
In dieser Tabelle sind Daten aus verschiedenen Verfahrensschritten der neun Patienten dargestellt. Entsprechend der anfänglichen Zellausbeute wurde für jede Probe ein variables Zellvolumen bestimmt. 1 Milliliter Proben mit höherer Zellausbeute, 1,1 Milliliter für Proben mit mittlerer Zellausbeute und 2 Milliliter pro Probe mit geringerer Zellausbeute.
Die zelluläre Ausbeute vor der Passage variierte stark, selbst wenn der gleiche Zusammenfluss vor der Trypsinisierung beobachtet wurde. Daher können hier die Zellen in Schichten gewachsen sein. Das repräsentative Bild zeigt die kunststoffadhärenten mesenchymalen ADSCs beim ersten Durchgang nach Isolierung bei der Lichtmikroskopie.
Die Zellen zeigen eine Adhäsion an die plastische und Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Die lebensfähigen Zellen, die in der Neubauer-Kammer im Trypanblau-Assay gezählt wurden, sind hier gezeigt. Die Durchflusszytometriedaten von sechs Patienten sind in dieser Tabelle dargestellt.
Aus diesen CD45-negativen Zellen wurde der Prozentsatz der ADSCs mit verschiedenen Kombinationen von Stammzellmarkern bestimmt. Die repräsentativen Bilder zeigen die Subpopulation von Zellen, die positiv für Stammzell-assoziierte Marker in SVF von Fall neun nach acht Monaten Kryokonservierung sind. Hier ist R1 die gesamte zelluläre Region, die im Vorwärtsstreu- versus Seitenstreudiagramm analysiert wird.
Und R2 ist die CD45-negative Region. CD73-, CD90- und CD105-Populationen sind in dieser Region positiv. Die ADSC-Differenzierung in Chondrozyten, Osteozyten und Adipozyten wird hier gezeigt.
Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, langsam zu rühren, vorzugsweise mit den Händen, während Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius stehen gelassen werden, um die Adhäsionen und Blasenbildung zu beobachten. Halten Sie die Temperatur im Arbeitsraum bei etwa 25 Grad Celsius und vermeiden Sie einen Temperaturschock bei viel höheren Temperaturen. Die Technik, die wir hier gezeigt haben, kann verwendet werden, um die pluripotenten mesenchymalen Zellen erfolgreich aus anderen Geweben zu isolieren.
