Dieses Protokoll bietet eine einfache kostengünstige Möglichkeit, ASCs ohne den Einsatz von harten Enzymen oder Zentrifugationsschritten zu isolieren, die den Zellphänotyp und das Verhalten verändern können. Das Fehlen harter Schritte führt zu weniger manipulierten Zellen als solche, die mit Enzymen und Zentrifugation isoliert sind, wodurch die Frage minimiert wird, ob experimentelle Beobachtungen ein Artefakt der Isolationsmethode sind. Diese Explant-Methode kann klinisch relevante ASCs erzeugen, die in einen Patienten eingeführt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln oder im Leben zu erweitern, die Forschungsanwendungen ermöglichen.
Es ist schwierig, die Hackmethode in Worten vollständig zu erklären. Die visuelle Demonstration kann anderen Wissenschaftlern die Schwierigkeiten des Lernens dienen, das Gewebe selbst auseinander zu brechen. Ähnliche Explantationsmethoden können verwendet werden, um andere Populationen von MSCs zu isolieren, z. B. solche aus Nabelgeweben.
Um die Abdominoplastik-Gewebeproben zu zerkleinern, übertragen Sie zuerst das Gewebe auf den Deckel einer sterilen 100-Millimeter-Platte. Verwenden Sie dann eine sterile Nadel, um ein Stück Gewebe an Ort und Stelle zu halten und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um das Gewebe in weniger als einen Millimeter Stücke zu schneiden. Übertragen Sie das Gewebe in ein frisches Rohr und invertieren oder schütteln Sie die Probe fünf- bis sechsmal, um das Mischen aller Schichten zu gewährleisten.
Dann, mit einem sterilen Spachtel, übertragen 2,5 bis fünf Milliliter Gewebe auf eine 100 Millimeter Vakuumgas Plasma behandelt Gewebe Kulturplatte. Messen Sie das Volumen der Probe, indem Sie in ein frisches Zentrifugenrohr gießen. Als nächstes fügen Sie ein gleichwertiges Volumen von Gewebekulturmedien auf die Platte und wirbeln Sie die Platte sanft, um den Inhalt zu mischen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Basis der Platte zu sehen sind. Sobald eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Platte oder nach sieben Tagen notiert sind, je nachdem, was früher ist, entfernen Sie alle verbleibenden Stücke des Gewebes. Als nächstes kulturieren Sie die ASCs in Gewebekulturmedien, bis sie 70% Konfluenz erreichen oder bis die Cluster dicht werden, an welchem Punkt die Zellen durchgehen sollen.
Spülen Sie die Platte vorsichtig mit 1X Phosphat gepufferte Kochsaline. Um die anhaftenden Zellen zu versuchen, die phosphatgepufferte Kochchen zu aspirieren, fügen Sie einen Milliliter Trypsin, ergänzt mit 0,25%EDTA, zu jeder Platte hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie eine kleine Menge Medien auf die Platte, um das Trypsin zu deaktivieren.
Dann pipette sanft das Medium Trypsin von der Oberseite der Platte nach unten, verlusterung alle schwach befestigten Zellen von der Platte. Um die Zellen auszusäen, fügen Sie zuerst Medien zur Platte hinzu. Fügen Sie dann die Zellen tropfenweise hinzu und wirbeln Sie dann die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung über die Platte zu gewährleisten.
Nach drei Passagen, gehen Sie zytometrie und Differenzierung Assays zu fließen. Nach drei Passagen wurden isolierte ASCs aus Lipoaspirat- und Abdominoplastikproben gefunden, die eine MSC-Morphologie und einen Phänotyp aufweisen, ähnlich wie isolierte ASCs nach einer enzymatischen Verdauung. Wie andere MSCs sind die explantisolierten ASCs negativ für CD45 und positiv für CD73, CD90 und CD105.
Beim Hacken des Gewebes muss die Oberfläche jedes Stückes ausreichend groß sein, damit die ASCs aus dem Gewebe wandern können. Dabei handelt es sich um grundlegende Stammzellen, die für ein breites Anwendungsspektrum eingesetzt werden können. Die isolierten ASCs können für jede nachgeschaltete Anwendung in vivo oder in vitro verwendet werden.
