Wir möchten Dr. George Commons und Dr. Dean Vistnes für ihre Unterstützung und Zusammenarbeit unserer Forschung danken. Diese Arbeit wird von National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung Zuschüsse 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 und RC2 DE020771-02, der Oak Foundation und Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medizin zum MTL Dr. Hyun unterstützt wird von der Saint Joseph Mercy Hospital GME unterstützt .

Ein. Zellisolation &amp; Expansion <ol><li> Alle Einwilligung des Patienten und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) genehmigt. </li><li> Erhalten menschlichen subkutanen Fettgewebe von elektiven lipoaspiration Verfahren unter örtlicher / Vollnarkose. </li><li> Es wird zwei Schichten in der lipoaspirate (1A) sein. Der Überstand enthält den größten Teil des verarbeiteten Zellmaterial. Die untere Schicht wird meistens injiziert Kochsalzlösung. Adipose-abgeleiteten Stromazellen aus beiden Schichten können geerntet werden, aber die Ausbeute ist wesentlich größer aus dem Überstand. </li><li> Die Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF) zu isolieren, wäscht den lipoaspirate ausgiebig mit gleichen Volumina von 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2,5% betadine (x2), die von gleichen Volumen von PBS 1X (x1) ohne betadine gefolgt. Lassen Sie die Wäsche auszufallen. </li><li> Achten Sie darauf, sterile te zu haltenchnique während des gesamten Prozesses, da eine Verunreinigung mit verarbeitetem menschlichem Gewebe passieren kann. </li><li> Saugen Sie die untere Schicht und entsorgen nach jeder Wäsche. </li><li> Aliquot 15 ml Fettgewebe in 50 ml BD Falcon konische Röhrchen. </li><li> Verdauen die Fettgewebe mit einem gleichen Volumen (15 ml) filtriert 0,075% Typ II Kollagenase in Balanced Salt Solution Hank (HBSS) bei 37 ° C in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständigem Rühren (ca. 180 schüttelt / min) - Belüftung jedes Rohr alle 15 min. </li><li> Neutralisieren Enzymaktivität mit 15 ml PBS, das 10% (Fetal Bovine Serum) FBS und Zentrifuge bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C, um eine mit hoher Dichte SVF Pellet zu erhalten. Das Pellet wird eine Mischung aus Fettgewebe gewonnen Stromazellen und Erythrozyten sein. </li><li> Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 10 ml herkömmlichen Nährmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung). </li><li> Filter Aufhängung<html> sion durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Kombinieren Sie 3 Rohre in ein sauberes 50 ml konisch. Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen, ohne dass der Pellet. </li><li> Das Pellet in 5 ml herkömmlichen Nährmedien </li><li> Kombinieren Sie zwei 50 ml Schrägen pro 10 cm Platte oder fünf 50 ml Schrägen für eine 15 cm Platte. </li><li> Stellen primären Kulturen über Nacht bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2. </li><li> Nach Inkubation über Nacht, wäscht die Platten ausgiebig mit PBS, um restliche nichthaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen. Die erhaltenen Zellpopulationen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen. </li><li> Pflegen Sie die Zellen bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C/21% O 2, 5% CO 2 in Nährmedien zu verhindern. Die Zellen müssen in der Regel aufgeteilt alle drei bis vier Tage in regelmäßigen Nährmedien werden, wenn bei 50% Konfluenz. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Gerüst Vorbereitung <ol><li> School of Dentistry - Gerüste wurden von Dr. Min Lee an der University of California, Los Angeles. </li><li> PLGA Gerüste wurden von 85/15 Poly (Milch-co-Glykolsäure) (inhärente Viskosität = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. </li><li> PLGA / Chloroformlösungen wurden mit 200-300 Mikrometer Durchmesser Saccharose gemischt bis 92% Porosität (Volumenanteil) und komprimiert zu dünnen Blechen in einer Teflonform erhalten. </li><li> Nach Gefriertrocknung über Nacht wurden Gerüste in drei Änderungen zweifach destilliertem (dd) H 2 O eingetaucht, um die Saccharose lösen und vorsichtig aus dem Teflon Platte mit einem feinen Spitze Spatel entfernt. </li><li> Nach teilchenförmigen Auslaugen wurden alle Gerüste durch Eintauchen in 50%, 60% und 70% Ethanol für 30 min jeden desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen mit ddH 2 O. </li><li> Alle Gerüste wurden unter einer Sterilbank getrocknet. </li><li> Nach Gerüst Fertigung, scaffolds wurden mit Apatit beschichtet ist. <ol class="ualpha"><li> SBF (simulierter Körperflüssigkeit) Lösung wurde mit Ionenkonzentrationen, die das 5-fache von menschlichem Blutplasma wurden hergestellt. Alle Lösungen wurden sterilfiltriert durch einen 0,22 um PES-Membran (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichtungsvorgang, getrocknet PLGA Gerüsten Glimmentladung, Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen wurden, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit verbessern. </li><li> Geätzten PLGA Gerüste wurden dann in SBF bei 37 ° C innerhalb einer Wassermantel-Inkubator für 12 Stunden, gefolgt durch Mg 2 + und HCO 3 - freien SBF 2 für weitere 12 Stunden bei 37 ° C unter leichtem Rühren. </li><li> Beschichtete PLGA Gerüste wurden vorsichtig mit steriler ddH 2 O gespült abzuwaschen Überschuß Natriumchloridlösung, in einer Sterilbank getrocknet und desinfiziert mit 70% Ethanol. </li><li> Integrität des Apatit-Beschichtung wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) analysiert. Apatitbeschichteten scaffolds wurden auf SEM Stubs (Ted Pella) montiert und beschichtet mit Kohlenstoff, um die Leitfähigkeit zu verbessern. Die Sekundär-Elektronen-Modus wurde während SEM (FEI / Phillips XL-30) Beobachtung angewendet. Energiedispersion Röntgenspektrum erhalten wurde, um elementaren Zusammensetzung der Apatitstrukturen bestätigen. </li></ol></li></ol> 3. Zellaussaat <ol><li> Bei Erreichen sub-Mündung Ebenen, waschen Sie die Zellen mit PBS (x2) und trypsinieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen für die Aussaat zu quantifizieren </li><li> Saatgut auf vorgeschnittenen 4,0 mm Durchmesser Gerüste mit 1,5 x 10 5 Zellen. <ol class="ualpha"><li> Ort einzelnen Gerüst in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte </li><li> Resuspendieren Zellen in regelmäßigen Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro 20 ul Medium </li><li> Pipette 20 ul direkt auf das Stützgerüst aufnehmen und in Zellkulturbrutschrank für 30 min. </li><li> Nach 30 min, 200 ul Medium und ermöglicht Zellen zu inkubierenauf dem Gerüst über Nacht vor der Operation </li><li> Es ist nicht notwendig, um sicherzustellen, Adhäsion der Zellen auf das Stützgerüst als Impfen eine ausreichende Anzahl von Zellen wird sicherstellen, dass eine Mehrheit wird auf das Stützgerüst zu befestigen. Dies wurde in unserem Labor in vivo mit Biolumineszenz und histologische Analyse validiert. </li></ol></li></ol> 4. Erstellung von Calvaria Mängel und in vivo-Implantation <ol><li> Anesthetize Erwachsenen (60 Tage alt) CD-1 Nacktmäusen mit Betäubung Cocktail. (Ketamin / Xylazin / Acepromazin) bei 50% Konzentration (1:1 Verdünnung mit 0,9% NaCl) oder per empfohlenen Anästhesie Therapie pro Institution Protokolle. Diese Mäuse sind athymischen so die hASCs nicht dazu führen, eine Immunreaktion. <ol class="lalpha"><li> Dosierung: Ketaminhydrochlorid (80 mg / kg), Xylazin (2,5 mg / kg) Acepromazin (2,5 mg / kg) </li><li> Wirkungsdauer: ca. 30 min </li></ol></li><li> Chirurgisch drapieren das Tier und sterilisieren die chirurgischeAufstellungsort mit betadine und Alkohol (x3) und decken die Mausaugen mit Salbe bevor eine Mittellinie sagittalen Schnitt in der Kopfhaut des Tieres, um den rechten parietalen Knochen freizulegen. Entfernen Sie die Perikranium von der rechten Scheitelbein mit stumpfen Schaben (Abbildung 1B). </li><li> Erstellen Sie eine einseitige 4-mm-Dicke Defekt in der rechten Nicht-Naht verbundenen Scheitelbein mit einer sterilen diamantbeschichteten trephine Bohrer. Extreme Vorsicht zu dürfen, um die zugrunde liegenden Dura mater (Abbildung 1B) wie die Maus Calvaria Dicke stören werden ist &lt;0,3 mm. </li><li> Vor der Implantation spülen Gerüsten mit steriler PBS auf Übertragung von Medium-Wachstumsfaktoren verhindern. </li><li> Legen Sie das Gerüst in den Defekt. </li><li> Schließlich nähen die Haut geschlossen und Überwachung der Tier pro etablierten postoperative Protokolle. </li><li> Verwenden gegründet Analgesie, wie von Ihrem animal care Protokolle nach Bedarf postoperativ-zB gerichtet. Buprenorphin 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Quantifizierung der Osteoidbildung <ol><li> Nach MicroCT an der Maus durchgeführt wurde, wurde das dreidimensionale Bild rekonstruiert MicroView Software, wie zuvor beschrieben ein. </li><li> Mit Adobe Photoshop, waren die Bilder so bemessen, dass ein Standard-Höhe. </li><li> Mit dem Zauberstab-Funktion wurden Pixel des Calvaria Defekt gemessen. </li><li> Prozentsatz Heilung des Mangels durch nachfolgende CT-Scans Messung der Calvaria Defektbereich und Bestimmung Pixelzahl und dividiert sie durch die ursprünglichen Mangel der Pixelanzahl bestimmt </li><li> Wenn folglich die MicroCT nicht verfügbar ist, wird eine alternative Verwendung von Adobe Photoshop und Ernten des Calvaria bei ermittelt Zeitpunkten für die Histologie. </li><li> Mithilfe histologischer Flecken wie Anilin Blau und Pentachrome die Osteoidbildung bezeichnen, sollten mehrere Abschnitte entlang der Spannweite des Mangels gebeizt </li><li> Mit Adobe Photoshop, Beschneiden, alle Bereiche, die nichtim Calvaria Defekt </li><li> Verwenden Sie den Zauberstab Funktion und bestimmen Pixelzahlen von de novo Knochenbildung im Bereich des Defekts und vergleichen, um Steuerelemente oder andere Variablen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Fettgewebe hat das Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Vorläuferzellen für die klinische Anwendung dienen. Fettgewebe hat einen einzigartigen Vorteil, dass es eine leicht verfügbar Versorgung, die in einem relativ einfachen Verfahren, das nur minimale Morbidität und Mortalität beinhaltet geerntet werden kann. Sobald das Gewebe wird geerntet und gesammelt, unser Protokoll in Abbildung 2 dargestellt. Fettgewebe-abgeleitete Stromazellen durch eine Reihe von Waschschritten Kollagenaseverdau und Zentrifugation isoliert. Sobald die Zellen in Kultur plattiert sind, können sie expandiert, in Verkehr in verschiedene Protokolle Differenzierung in vitro oder in vivo direkt platziert. Die creation der 4 mm-kritische Größe Calvaria Defekt stellt eine leicht zugängliche und reproduzierbare in vivo-Modell um die osteogene Differenzierung Fähigkeit unserer Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen testen. Durch den Einsatz von MicroCT, sind wir in der Lage, die Bildung von Knochengewebe in vivo zu verfolgen und den Fortschritt unserer Interventionen (Abbildung 3). Die kritische Größe Calvaria Defekt wird nicht innerhalb der Lebensdauer des Tieres zu heilen und wir sehen rund 90% des Defekts Patent bleiben rund 8 Wochen. Das Gerüst selbst (siehe Diskussion) hat osteogene induktiven Eigenschaften und hat gezeigt, die Fähigkeit, einige knöcherne Regeneration induzieren. Die typischen Ergebnisse Gerüst Platzierung ohne Zellen zeigt, dass rund ein Drittel der Defekt wird de novo Knochenbildung bei 8 Wochen. Mit der Zunahme von Fettgewebe gewonnen Stromazellen, volle zwei Drittel oder mehr der Defekt wird Knochenregeneration bei rund 8 Wochen zeigen, obwohl es Variability zwischen den einzelnen Tier-und Chirurgie. Die Bildung von Knochengewebe durch Histologie quantifiziert werden und typische Ergebnisse zeigen erhöhte Osteoidbildung in Proben mit ASCs durch Anilinblau und Pentachrome Färbung (3C). Darüber hinaus zeigen wir, dass die implantierten menschlichen Zellen auf die zugrunde liegende de novo knöchernen Bildung beitragen, durch die Verwendung von GFP-markierten hASCs die Färbung zeigen in vivo nach 2 Wochen nahe dem Bereich der de-novo-Knochenbildung im Calvaria Defekt (Figur 3D) . Zusätzlich verwenden wir Immunhistochemie mit menschlichen spezifischen Antikörpers gegen menschliches Zellüberleben und Beitrag im Bereich des Defektes (3E) zu zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Abbildung 1 A -. Die lipoaspirate hat zwei Schichten. Die oberste Schicht enthält die Adipozyten und die Mehrheit der processes Zellmaterial während die untere Schicht die Salzlösung während der lipoaspiration Verfahren verwendet. B - die Schaffung des Calvaria Defekt durch eine Inzision über dem Perikranium die richtige Scheitelbein, anschließende Einrichtung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekts ohne Unterbrechung des zugrunde liegenden Dura mater zu isolieren. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Abbildung 2. Übersicht der Erntemaschine und Anwendung lipoaspirate aus der Isolierung von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen, um ihre Expansion, Differenzierung und Verwendung in vitro und in vivo. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein-MicroCT zeigt in vivo Heilung der kritischen Größe Calvaria Defekt mit der Anwendung über eine ASCs hydroxyapatitie Gerüst (untere Reihe). Die Kontrollen umfassen keine Gerüst und Defekt (obere Reihe) und Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen (mittlere Reihe) B - Quantifizierung der Knochenheilung vom MicroCT zeigt deutlich erhöht Heilung in der ASC-Gruppe. C - Histologie zeigt erhöhte Osteoidbildung der ASC-Gruppe (untere Reihe) durch Anilin Blau und Pentachrome Färbung. Für Anilin Blau, die Osteoid Flecken dunkelblau und für Pentachrome, die Osteoid Flecken gelb. D - hASCS mit GFP-markierten wurden auf einem Gerüst ausgesät und in eine Calvaria Defekt gelegt und opferte bei 2 Wochen. Die Färbung wurde mit einem GFP-markierten Antikörper, die menschlichen Zellen Beitrag zur Regeneration in der Stelle des Defekts anzuzeigen getan. E -. Menschliche nuclear antigen Immunhistochemie zeigt Prävalenz von menschlichen Zellen im Bereich des Defektes nach 2 Wochen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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	<li>Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose-derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defect.">Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li><li>Keefe, M. S., Keefe, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+effectiveness+of+different+techniques+for+intraoperative+antibiotics+into+alloplastic+implants+for+use+in+facial+reconstruction.">An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction.</a> Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).</li><li>Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells:+Temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers.">Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li><li>Dominici, M., Blanc, K. L. e., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stroma+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li><li>Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects.</a> Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).</li><li>Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects.">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).</li><li>Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+responses+to+bone-mimetic+electrospun+matrices+composed+of+polycaprolactone,+collagen+I+and+nanoparticulate+hydroxyapatite.">Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoinduction+by+calcium+phosphate+biomaterials.">Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).</li><li>Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enchancement+of+osteogenesis+by+nano-fibrous+scaffolds+incorporating+rhBMP-7+nanospheres.">The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres.</a> Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).</li><li>Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+silk-BMP-2+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).</li><li>Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+adenovirus+combined+silk+fibroin+scaffolds+for+bone+morphogenetic+protein-7+gene+delivery.">In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).</li><li>Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-integrating+knockdown+and+customized+scaffold+design+enhances+human-adipose-derived+stem+cells+in+skeletal+repair.">Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair.</a> Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Da die Isolation von Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen 2 ab lipoaspirate wurden diese Zellen in einer Vielzahl von zellulären Abstammungslinien differenziert. Fettgewebe ist aus mesodermalen Ursprungs und daher multipotent Fettgewebe gewonnene Stromazellen wird wahrscheinlich am effektivsten mit der Anwendung zu einem mesodermalen Linie. Die Fähigkeit, Skelettgewebe erzeugen ist besonders kritisch, da der Mangel an Entnahmestellen für eine autologe und die damit verbundenen Einschränkungen aus Kunststo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz: </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate Ernte </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Cellgro </td><td> 21-023-CV </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-top 500 ml 0,22 um-Filter </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Calvaria Defect </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Knife 4,0 mm </td><td> Xemax Surgical </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate

Kraniofazialen skelettalen Reparatur und Regeneration bietet das Versprechen von de novo Gewebebildung durch einen Zell-basierten Ansatz Verwendung Stammzellen. Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC) haben sich eine reiche Quelle von multipotenten Stammzellen fähig ist, osteogene, chondrogener, adipogene und myogenen Differenzierung. Viele Studien haben die osteogene Potential dieser Zellen in vivo untersucht unter Verwendung von verschiedenen Biomaterialien Gerüst für zellulare Lieferung. Es hat sich gezeigt, dass durch Verwendung eines osteokonduktiven, Hydroxylapatit-beschichteten Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA HA-) Gerüst seeded mit ASCs eine kritische Größe Calvaria Defekt, ein Defekt, der durch seine Unfähigkeit, eine spontane definiert ist Heilung über die gesamte Lebensdauer des Tieres, kann wirksam werden zeigen, robust Knochenregeneration. Diese in vivo Modell zeigt die Grundlage für translationale Ansätze gerichtet, um den Knochen zu regenerieren - die zelluläreKomponente und biologischen Matrix. Diese Methode dient als Modell für die letztendliche klinische Anwendung einer Vorläuferzelle in Richtung der Reparatur eines Gewebedefekts bestimmten.

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Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Fettgewebe gewonnen Stromazellen aus lipoaspirate und die Schaffung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekt Skelett Regeneration zu bewerten.

Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Forschung

Medizin

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

Erstellen Starr stabilisierte Frakturen zur Beurteilung intramembranöse Ossifikation, Distraktionsosteogenese, oder Heilung von kritischer Größe Mängel

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Eine Maus fetalen Hautmodell von Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Eine einfache Kritische große Femoral Defect Modell an der Maus

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem cells can be obtained from different tissues and several methods for isolation have been described. The presented method for the isolation of adipose-derived regenerative cells (ADRCs) can be used within many therapeutic areas because the method is a general procedure and, therefore, not limited to erectile dysfunction (ED) therapy. ED is a common and serious side effect to radical prostatectomy (RP) since ED often is not well treated with conventional therapy. Using ADRC&#8217;s as treatment for ED has attracted great interest due to the initial positive results after a single injection of cells into the corpora cavernosum. The method used for the isolation of ADRC&#8217;s is a simple, automated process, that is reproducible and ensures a uniform product. Furthermore, the sterility of the isolated product is ensured because the entire process takes place in a closed system. It is important to minimize the risk of contamination and infection since the stem cells are used for injection in humans. The whole procedure can be done within 2.5-3.5 hours and does not require a classified laboratory which eliminates the need for shipping tissue to an off-site. However, the procedure has some limitations since the minimum amount of drained lipoaspirate for the isolation device to function is 100 g.

Precise disclosure of methods and protocols is crucial for large scale uptake of stem cell therapies. Here, we present a protocol to isolate adipose-derived regenerative cells, used for a single intracavernous injection as treatment of erectile dysfunction (ED) following radical prostatectomy (RP).

Isolierung von adipös abgeleiteten regenerativen Zellen zur Behandlung der erektilen Dysfunktion nach radikaler Prostatektomie

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Ein neonatales BALB/c-Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mechanische stromale vaskuläre Fraktion in Fibrinhydrogel für die regenerative Medizin

The Combination of Mechanically Isolated Stromal Vascular Fraction and Fibrin Hydrogel: A Processing Protocol

The regenerative potential of adipose-derived stromal cells (ASCs) has gained significant attention in regenerative and translational research. In the past, the extraction of these cells from adipose tissue required a multistep enzyme-based process, resulting in a heterogenous cell mix consisting of ACSs and other cells, which are jointly termed the stromal vascular fraction (SVF). More recently introduced mechanical SVF (mSVF) isolation protocols are less time-consuming and bypass regulatory concerns. We recently proposed a protocol that generates mSVF rich in stromal cells based on a combination of emulsification and centrifugation. One current issue in mSVF application for wound therapy application is the lack of a scaffold providing protection from mechanical manipulation and desiccation. Fibrin hydrogels have been shown to be a useful adjunct in cell transfer for wound healing purposes in the past. In the work herein, we delineate the preparation steps of an mSVF-fibrin hydrogel construct as a novel approach for translational research and clinical application.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung des Potenzials der aus Fett gewonnenen stromalen Gefäßfraktion für die Wundheilung

Mechanically isolated stromal vascular fraction (SVF) in combination with a fibrin hydrogel offers an easy and efficient carrier for viable adipose-derived stromal cells for various indications, including tissue engineering and or wound healing purposes. Here, we present the preparation of a mechanical SVF (mSVF)-fibrin hydrogel construct for translational research and clinical application.

Die Kombination aus mechanisch isolierter stromaler vaskulärer Fraktion und Fibrinhydrogel: Ein Verarbeitungsprotokoll

The regenerative potential of adipose-derived stromal cells (ASCs) has gained significant attention in regenerative and translational research. In the ...