In meinem Labor entwickeln wir Produktionssysteme für virale Vektoren und virusähnliche Partikel oder VLP-basierte Impfstoffe. Der VLP-Capture-Assay ermöglicht den sehr sensitiven Nachweis von Zielantigenen, die auf VLPs angezeigt werden. In diesem Assay verwenden wir breit neutralisierende Antikörper, die gegen Neutralisationsepitope gerichtet sind, um die Exposition dieser Epitope auf der VLP-Oberfläche nachzuweisen.
Dies ist eine wichtige Qualitätsbewertung für Impfstoffkandidaten, da nur VLPs mit neutralisationsempfindlichen Epitopen in der Lage sein werden, eine neutralisierende Antikörperantwort in Impfstoffen auszulösen. Beginnen Sie mit dem Aufhängen der Magnetperlen, indem Sie entweder auf und ab pipettieren oder mindestens fünf Minuten lang auf einem Rotator mit 50 U / min mischen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Antikörperlösung vor, die die bNABs enthält.
Verwenden Sie 10 Mikrogramm von jedem bNAB in 200 Mikroliter Antikörperbindung und Waschpuffer pro Reaktion. Für jede Reaktion 50 Mikroliter der magnetischen Perlenlösung in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr übertragen und dann die Röhrchen auf das magnetische Trenngestell legen. Warten Sie, bis sich die Perlen an der Rohrkugel sammeln, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt sind, und entfernen Sie dann den Überstand.
Entfernen Sie den Magneten und suspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern der zuvor hergestellten bNAB-Lösung. Inkubieren Sie für 30 Minuten bis drei Stunden, während Sie auf einem Rotator bei 50 U / min bei Raumtemperatur mischen. Legen Sie nach der Inkubation die Reaktionsrohre in das magnetische Trenngestell, warten Sie und entfernen Sie den Überstand.
Entfernen Sie die Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die Perlen, indem Sie sie in 200 Mikrolitern Antikörperbindung und Waschpuffer wieder suspendieren. Wiederholen Sie die Wäsche mit Antikörperbindung und Waschpuffer und entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich, wenn Sie fertig sind. Fügen Sie die Proben zu den perlengebundenen bNABs hinzu.
Wenn das zugesetzte Probenvolumen unter einem Milliliter liegt, fügen Sie PBS hinzu, um das Probenvolumen auf einen Milliliter einzustellen, und suspendieren Sie dann die Perlen durch vorsichtiges Pipettieren erneut. Inkubieren Sie die Proben und Kügelchen für 2,5 Stunden auf einem Rotator bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die Kügelchen in Suspension bleiben und die Lösung während der Inkubation gründlich gemischt wird. Legen Sie die Röhrchen auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand, dann waschen Sie die Magnetperlen, indem Sie sie in 200 Mikrolitern Waschpuffer aufhängen.
Suspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikroliter Waschpuffer und übertragen Sie die Suspension in ein sauberes, hitzebeständiges Reaktionsrohr. Legen Sie das Rohr auf das magnetische Trenngestell und entfernen Sie den Überstand vollständig. Um denaturierte STS-PAGE-Proben herzustellen, suspendieren Sie die Kügelchen in 20 bis 80 Mikroliter Laemmli-Puffer und inkubieren Sie bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.
Fahren Sie direkt mit SDS-PAGE fort und legen Sie die Röhren auf ein Magnetgestell, um die Perlen von der Lösung zu trennen. Alternativ lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius. Ein repräsentatives Ergebnis von VLPs, die zuerst aus zellfreien Zellkultur-Überständen und VLP-Pellets unter Verwendung von bNABs gefangen und anschließend einer Western-Blot-Analyse unterzogen wurden, um virale Kernproteine nachzuweisen, wird hier gezeigt.
Die für den Capture-Assay verwendeten Kügelchen wurden mit drei verschiedenen bNABs beschichtet, die gegen Neutralisationsepitope der Hüllglykoproteine und Isotyp-Antikörper gerichtet waren, die als Negativkontrollen dienten. Unter Verwendung von Isotopenantikörper-beschichteten Kügelchen waren keine Gag-Proteine in VLP-Proben nachweisbar, die kahle VLPs, dh Env-negative VLPs oder Env-anzeigende VLPs, enthielten, was zeigt, dass die unspezifische Bindung von VLPs an Perlen, die mit menschlichen Antikörpern beschichtet waren, keine VLP-Erfassung vermittelte. Kahle VLPs waren auch nicht an bNABs-beschichtete Kügelchen gebunden, und folglich waren in der Western-Blot-Analyse keine Gag-Proteine nachweisbar.
Im Gegensatz dazu fingen alle drei bNABs VLPs ein, die Env-Proteine zeigten, daher konnten Gag-Proteine leicht nachgewiesen werden, was das Vorhandensein von Neutralisationsepitopen in den auf VLPs angezeigten Env-Glykoproteinen zeigte. Dies wird am besten mit Volumina erreicht, die größer als 500 Mikroliter unter Rotation sind.
Alternativ können erfasste VLPs unter nicht reduzierenden Bedingungen eluiert werden. Dies ermöglicht die Analyse von VLPs mittels Immunelektronenmikroskopie oder die Untersuchung der angezeigten Antigene mittels nativer PAGE.
