В моей лаборатории мы разрабатываем производственные системы для вирусных векторов и вирусоподобных частиц или вакцин на основе VLP. Анализ захвата VLP позволяет очень чувствительно обнаруживать целевые антигены, отображаемые на VLP. В этом анализе мы используем широко нейтрализующие антитела, направленные против эпитопов нейтрализации, чтобы доказать воздействие этих эпитопов на поверхность VLP.
Это важная оценка качества для вакцин-кандидатов, поскольку только VLP, демонстрирующие чувствительные к нейтрализации эпитопы, смогут вызвать нейтрализующий ответ антител у вакцин. Начните с приостановки магнитных шариков, либо пипеткой вверх и вниз, либо смешиванием на ротаторе при 50 оборотах в минуту в течение не менее пяти минут. Тем временем готовят раствор антител, содержащий bNABs.
Используйте 10 микрограммов каждого bNAB в 200 микролитрах буфера связывания антител и промывки на реакцию. Для каждой реакции переложите 50 микролитров раствора магнитного шарика в реакционную трубку объемом 1,5 миллилитра, затем поместите трубки на магнитную разделительную стойку. Подождите, пока бусины соберутся на трубчатом шаре, чтобы убедиться, что все бусины собраны, затем удалите супернатант.
Снимите магнит и подвешивайте шарики в 200 микролитрах предварительно приготовленного раствора bNAB. Инкубировать от 30 минут до трех часов, смешивая на ротаторе при 50 об/мин при комнатной температуре. После инкубации поместите реакционные трубки в стойку магнитного разделения, подождите и удалите супернатант.
Извлеките трубки из магнита и вымойте бусины, повторно подвешивая в 200 микролитрах буфер связывания антител и промывки. Повторите промывку с антителами, связывая и промывочный буфер, удаляя как можно больше промывочного буфера по завершении. Добавьте образцы в связанные с шариками bNAB.
Если добавленный объем образца составляет менее одного миллилитра, добавьте PBS, чтобы отрегулировать объем образца до одного миллилитра, а затем повторно приостановите шарики путем осторожного пипетирования. Инкубируйте образцы и бусины в течение 2,5 часов на ротаторе при комнатной температуре, следя за тем, чтобы шарики оставались в суспензии, а раствор тщательно перемешивался во время инкубации. Поместите трубки на магнит и удалите супернатант, затем промыть магнитные шарики, подвесив их в 200 микролитрах промывочного буфера.
Суспендировать шарики в 100 микролитрах промывочного буфера и перенести суспензию в чистую, термостойкую реакционную трубку. Поместите трубку на магнитную разделительную стойку и полностью удалите супернатант. Чтобы подготовить денатурированные образцы STS-PAGE, суспендируйте шарики в 20-80 микролитрах буфера Laemmli и инкубируйте при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Переходите непосредственно к SDS-PAGE, размещая трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бусины от раствора. Кроме того, храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Репрезентативный результат VLP, впервые захваченных из бесклеточной клеточной культуры супернатанта и гранул VLP с использованием bLAB, а затем подвергнутых анализу вестерн-блоттинга для обнаружения белков вирусного ядра, показан здесь.
Шарики, используемые для анализа захвата, были покрыты тремя различными bLAB, направленными против эпитопов нейтрализации гликопротеинов оболочки и антител изотипа, служащих отрицательным контролем. Используя шарики, покрытые изотопными антителами, белки Gag не были обнаружены в образцах VLP, содержащих лысые VLP, то есть Env-отрицательные VLP или ENV-дисплейные VLP, демонстрируя, что неспецифическое связывание VLP с шариками, покрытыми человеческими антителами, не опосредует захват VLP. Лысые VLP также не были связаны шариками, покрытыми bNAB, и, следовательно, никакие белки Gag не были обнаружены в анализе вестерн-блоттинга.
Напротив, все три bLAB захватывали VLP, отображающие Env-белки, поэтому белки Gag были легко обнаружены, демонстрируя наличие эпитопов нейтрализации в Env-гликопротеинах, отображаемых на VLP. Решающее значение для успеха анализа: тщательное смешивание VLP с шариками, покрытыми антителами. Лучше всего это достигается при использовании объемов более 500 микролитров при вращении.
В качестве альтернативы, захваченные VLP могут быть элюированы в условиях, не уменьшающихся. Это позволяет анализировать VLP с использованием иммуноэлектронной микроскопии или исследовать отображаемые антигены с использованием нативного PAGE.
