Diese Methode bietet eine Möglichkeit, eine der wichtigeren Fragen zu den in der Entwicklung befindlichen SARS-Coronavirus-2-Impfstoffen zu beantworten. Ist der Impfstoff in der Lage, eine neutralisierende Antikörperreaktion auszulösen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in einer Einrichtung der zweiten Sicherheitsstufe durchgeführt werden kann.
Es ist auch relativ schnell und kostengünstig, so dass es gut geeignet ist, viele Proben gleichzeitig zu analysieren. Wir haben Ricardo Marius, einen leitenden Techniker im Labor, und Taylor Jamieson, einen MD-Doktoranden, demonstriert das Neutralisierungssäureverfahren. Beginnen Sie mit der Kultivierung von Vero E6-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10% FBS bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Um die Zellen zu passieren, waschen Sie sie zuerst, indem Sie 10 Milliliter PBS hinzufügen und die Schüssel vier- bis fünfmal vorsichtig schaukeln. Nachdem Sie das PBS angesaugt haben, fügen Sie drei Milliliter Trypsin EDTA hinzu und rocken Sie die Schüssel, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist, bevor Sie sie bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald sich die Zellen gelöst haben, deaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie sieben Milliliter DMEM hinzufügen, ergänzt mit 10% FBS, und resuspendieren Sie die Zellen dann, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
Entfernen Sie das Trypsin durch Zentrifugation und aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, bevor Sie die Zellen in 10 Milliliter frischem DMEM wiederverwenden. Nach dem Zählen etwa einmalig 10 zu den siebten Zellen zu jeder 15 Zentimeter großen Platte geben und die Kultur für ein bis zwei Tage inkubieren, bis die Zellen zu 100% konfluent sind. Um das VSV-Spike-EGFP-Pseudovirus für die Titerierung vorzubereiten, infizieren Sie die Zellen bei 0,01 Vielfachkeit der Infektion mit dem Inmaterialvirus, das in 12 Milliliter serumfreiem DMEM verdünnt ist.
Nach Zugabe des Virus die Zellen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit gelegentlichem Schaukeln inkubieren. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Inokulum durch frisches DMEM, das mit 2% FBS und 20 Millimolhaufen ergänzt wird, und inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang bei 34 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Fluoreszenzmikroskop, um die EGFP-Expression der infizierten Zellen sichtbar zu machen.
Sobald ein ausgedehnter zytopathischer Effekt und eine Zellablösung beobachtet wurden, sammeln Sie den Kulturüberstand und entfernen Sie die Trümmer durch Zentrifugation. Um mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, aliquotieren Sie den Überstand vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Um den Virustiter zu bestimmen, platten Sie Vero E6-Zellen in sechs Vertiefungsplatten mit einer Aussaatdichte von sechs mal 10 bis zur fünften Zelle pro Vertiefung und inkubieren über Nacht.
Am nächsten Tag richten Sie eine zehnfache serielle Verdünnungsserie des Virusbestands ein, indem Sie 900 Mikroliter Medium zu sieben Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen und 100 Mikroliter Virusmaterial in das erste Röhrchen geben. Nach kurzem Wirbeln 100 Mikroliter verdünntes Virus in jedes nachfolgende Röhrchen übertragen und zwischen jedem Röhrchen wirbeln. Ersetzen Sie dann den Überstand in jeder Vertiefung der Vero E6-Kulturplatte durch 500 Mikroliter der 10 bis minus Sekunde bis 10 bis minus siebten Virusverdünnungen.
Nach einer 45-minütigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit sanftem Schaukeln alle 15 Minuten ersetzen Sie das Inokulum durch eine Overlay-Lösung und inkubieren die Zellen bei 34 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Um die Plaques am Ende der Inkubation durch Kristallviolettfärbung sichtbar zu machen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, bevor Sie zwei Milliliter mit 0,1% Kristallviolett in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Platte für ca. 20 Minuten bei Raumtemperatur auf eine Wippe, bevor Sie jede Vertiefung zweimal vorsichtig mit PBS waschen.
Lassen Sie die Platten nach der letzten Wäsche mindestens eine Stunde an der Luft trocknen, bevor Sie die Formel wie angegeben verwenden, um den Titer des Virus in jeder Vertiefung in plaquebildenden Einheiten pro Milliliter zu berechnen. Um Zellen für einen Neutralisationsassay zu platten, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter Vero E6-Zellen zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von zweimal 10 bis zur fünften Zelle pro Milliliter hinzuzufügen und die Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu inkubieren. Am nächsten Tag inaktivieren Sie die Serumproben des Patienten, die in einem 56 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Minuten getestet werden sollen, mit Hitze.
Stellen Sie dann eine zehnfache Verdünnungsreihe der Serumproben des Patienten in einer leeren 96-Well-Gewebekulturplatte auf, indem Sie acht Mikroliter des Serums zu 72 Mikrolitern serumfreiem DMEM mit Antibiotika in jeder Vertiefung der Reihe A hinzufügen.Dann fügen Sie 40 Mikroliter serumfreies DMEM zu jeder Vertiefung der Reihen B bis G und 80 Mikroliter zu jeder Vertiefung der Reihe H hinzu. Mischen Sie die Proben in Reihe A und übertragen Sie dann 40 Mikroliter der Probe von jedem Bohrloch der Reihe A in jedes Bohrloch der Reihe B.Wiederholen Sie nach dem Mischen die Verdünnung für jede nachfolgende Reihe von Vertiefungen bis zur Zeile F.Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter VSV-Spike EGFP bei 0,05 Infektionsmultiplikation zu jeder Vertiefung in den Reihen A bis G hinzu. und vier- bis fünfmal pipettieren, bevor sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Am Ende der Inkubation wird der Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung der Vero E6-Kulturplatte abgesaugt und 60 Mikroliter Antikörpervirusmischung aus jeder Vertiefung der Probenverdünnungsplatte in die entsprechende Vertiefung der Zellkulturplatte übertragen. Wenn alle Proben übertragen wurden, platzieren Sie die Zellkulturplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde mit Schaukeln alle 20 Minuten.
Nach Abschluss der Inkubation werden 140 Mikroliter Carboxymethylcellulose-Overlay-Lösung in jede Vertiefung der Zellkulturplatte gegeben und die Platte in einen 34 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator überführt. Nach 24 Stunden können Sie die Platten auf einem automatisierten Fluoreszenzbildner mit einer Wellenlänge von 488 Nanometern abbilden und die automatisierte Zählfunktion des Imagers verwenden, um die einzelnen EGFP-Brennpunkte zu quantifizieren. In diesem repräsentativen Beispiel wurde ein kommerziell erhältlicher neutralisierender Antikörper gegen die SARS-Coronavirus-2-Spikerezeptor-Bindungsdomäne als Positivkontrolle neben IgG als Negativkontrolle verwendet.
Die prozentuale Hemmung wurde basierend auf der Anzahl der EGFP-Herde berechnet, die über Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen wurden. Pseudovirus-Neutralisation durch rekonvaleszente Patientenproben, die etwa drei Monate nach der SARS-Coronavirus-2-Infektion gesammelt wurden, zeigten, dass hospitalisierte Patienten eine erhöhte Neutralisierungsfähigkeit im Vergleich zu denen zeigten, die keinen Krankenhausaufenthalt benötigten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um andere COVID-19-Präventions- und Therapeutika zu bewerten, die darauf abzielen, eine Virusinfektion zu blockieren.
